Влияние предшественника лей-энкефалина на активность ферментов обмена регуляторных пептидов головного мозга и периферических органов крыс в норме и при эмоционально-болевом стрессе

p align="left">Сравнение уровня активности исследуемых пептид-гидролаз показывает наличие ряда сходных черт в динамике изменения активности ферментов. Так КПН и ФМСФ-ингибируемая КП практически во всех исследованных отделах мозга и тканях, а также АПФ в гипофизе, стриатуме и семенниках характеризуются достоверным повышением активности через 0,5 и 4 часа. Наиболее выраженный характер изменения носили в тех отделах мозга и органах, которые характеризуются повышенным содержанием таких регуляторных пептидов как ПВДС, энкефалины, вещество Р [156]. Увеличение активности исследуемых ферментов при введении лей-энкефалин-арг показано также в отделах синтезирующих нейропептиды. Полученные данные, свидетельствуют о включении КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в ответ организма на введение предшественника лей-энкефалина.

3.4. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИН-АРГ НА АКТИВНОСТЬ КПН, ФМСФ-ИНГИБИРУЕМОЙ КП И АПФ IN VITRO

Согласно литературным данным активность КПН in vitro ингибируется такими нейропептидами, как энкефалины, вазопрессин, вещество Р, окситоцин [207]. Подобное действие оказывают опиоидные пептиды и -липотропин на активность АПФ [160].

Особый интерес для выяснения механизмов действия экзогенно-введенного лей-энкефалин-арг представляет исследование in vitro влияния предшественника лей-энкефалина на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ. Полученные данные представлены в таблице 3.

В опытах in vitro на изолированных надпочечниках, гипофизе и больших полушариях обнаружено, что добавление лей-энкефалин-арг в концентрации 2,4мМ, приводит к подавлению активности КПН и АПФ. Более выраженное подавление активности КПН и АПФ обнаружено в надпочечниках. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в изолированных надпочечниках, гипофизе и больших полушариях in vitro практически не изменяется по сравнению с контрольными пробами.

Как было показано выше, в опытах in vivo активность ферментов при инстилляции пропептида повышалась. Обнаруженное несоответствие во влиянии лей-энкефалин-арг на активности изучаемых ферментов обмена регуляторных пептидов in vitro и in vivo показывает, что влияние предшественника лей-энкефалина на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ опосредовано.

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЛЕЙ-ЭНКЕФАЛИН-АРГ НА АКТИВНОСТЬ КПН, ФМСФ-ИНГИБИРУЕМОЙ КП И АПФ НА ФОНЕ ОСТРОГО ЭМОЦИОНАЛЬНО-БОЛЕВОГО СТРЕССА.

Известно, что коррекция последствий острых стресс-воздействий с использованием традиционных средств в большинстве случаев не достаточно эффективна. Наблюдаемая после воздействия стресса несоответствие процессов синтеза и секреции многих регуляторных пептидов, а также блокада их рецепторов продуктами метаболизма приводит к истощению нейрогуморальных систем [22, 106, 111, 176]. Одним из способов естественной профилактики повреждений, вызванных чрезмерной реакцией на действие экстремальных факторов, является активация эндогенной стресс-лимитирующей системы опиоидных пептидов за счет их экзогенного введения [116, 135]. Однако полифункциональность опиоидов, становится лимитирующим фактором для их применения при различных патологиях ЦНС. Известно, что введение извне энкефалинов, их предшественников и синтетических аналогов, устойчивых к действию пептидгидролаз, может в значительной мере ослабить или даже устранить патологические изменения в условиях разных видов стресс-воздействия [23, 69, 102]. При этом, особенности фармакологического действия энкефалинов зависят от их энзимоустойчивости и стабильности в крови, способности проникать через гемато-энцефалический барьер (ГЭБ).

Известно, что при стрессе предварительное введение лей-энкефалина или его синтетического аналога даларгина уменьшает подъем уровня кортикостерона в организме - одного из компанентов стресс-реализующих систем [69, 105, 123]. Полагают, что экзогенно вводимые опиоидные пептиды могут способствовать “запуску” ряда эндогенных реакций синтеза или деградации других биологически активных пептидов, в том числе и обладающих антистрессорным действием [11, 13, 78, 113, 119]. Известно, что образование и инактивация регуляторных пептидов осуществляется при участии ферментов пептид-гидролаз.

В связи с вышесказанным интересным представляется исследование влияния предшественника лей-энкефалина на активность изучаемых ферментов обмена регуляторных пептидов в динамике острого ЭБС.

Проведены исследования влияния лей-энкефалин-арг на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс, подверженных острому ЭБС. Предшественник лей-энкефалина вводился непосредственно перед началом стрессирования в дозе 20 мкг/кг веса животного. Активность ферментов в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс определяли через 0,5 часа, 4 часа, 24 часа, 72 часа и 10 суток после совместного воздействия пропептида и острого ЭБС. Сравнение полученных данных проводилось относительно соответствующих показателей активности ферментов интактных и животных, подверженных ЭБС. Результаты исследования представлены в таблицах 5-7 (приложение) и рис. 7-9.

3.5.1. Активность КПН при введении лей-энкефалин-арг на фоне острого ЭБС.

Данные проведенных исследований (табл.5, рис. 7) показывают, что при введении предшественника лей-энкефалина стрессированным животным, активность КПН изменяется в тех отделах мозга, которые, по классическим представлениям, связаны с синтезом стресс-протективных веществ [14, 140, 156, 185]. Наиболее выраженное повышение активности фермента, по сравнению и группой интактных животных, обнаружено в гипофизе, стриатуме, гипоталамусе и больших полушариях. Существенное повышение активности отмечено также в семенниках. Как было показано выше (раздел 3.2.1.) активность КПН в гипофизе и стриатуме при воздействии острого ЭБС также повышается.

Однако, как показывают данные проведенных исследований, изменения активности КПН у группы животных, которым на фоне стресса вводился лей-энкефалин-арг отличается от таковых при воздействии острого ЭБС по динамике и степени выраженности.

Введение лей-энкефалин-арг перед началом стресс-воздействия предотвращало повышение активности КПН в гипофизе (табл.5, рис.7). Активность фермента через 0,5 и 4 часа не отличалась от нормы. Через 24 и 72 часа она была выше активности фермента у интактных животных на 21% (p<0,05) и 40% (p<0,01), соответственно (рис.7). Однако повышение активности КПН было меньшим по сравнению с животными, не получавшими лей-энкефалин-арг перед стрессом (рис.7). Через 10 суток статистически значимых изменений активности фермента, по сравнению с нормой и с стрессированными животными, обнаружено не было.

В стриатуме через 0,5 и 4 часа активность КПН превышала показатели интактных животных на 28% (p<0,001) и 33%(p<0,01) и стрессированных животных на 28% (p<0,01) и 20% (p<0,01), соответственно (табл.5, рис.7). Через 24 часа не отличалась от активности фермента у обеих сравниваемых групп. Через 72 часа активность КПН была выше нормы на 39% (p<0,01) и не отличалась от таковой при стрессе. Через 10 суток после совместного воздействия лей-энкефалин-арг и острого ЭБС активность фермента не отличалась показателей нормы и стрессированных животных.

Статистически достоверное повышение активности КПН, как по сравнению с интактными животными, так и по сравнению с группой животных, подверженных воздействию острого ЭБС, отмечено через 4 часа в больших полушариях - отделе, характеризующимся высоким содержанием нейропептидов (табл.5, рис.7). Активность фермента при этом превышала соответствующие показатели на 33%( p<0,01).

Предварительное введение перед стрессом лей-энкефалин-арг предотвращало снижение активности КПН в среднем мозге и гиппокампе через 4 часа после воздействия. Активность фермента при этом практически не отличалась от нормы и превышала соответствующие показатели стрессированных животных на 33%( p<0,01) в среднем мозге и на 63% (p<0,001) в гиппокампе (рис.7). Через 0,5, 24 , 72 часа и 10 суток после совместного воздействия лей-энкефалин-арг и стресса не отличалась от таковой у обеих сравниваемых групп (рис.7).

В надпочечниках через 0,5, 24, 72 часа и 10 суток активность КПН не отличалась от соответствующих показателей стрессированных и интактных животных, а через 4 часа была выше таковой, у животных подверженных воздействию острого ЭБС (+117%, p<0,001) и не отличалась от нормы (рис.7).

В семенниках после совместного воздействия двух факторов обнаружены статистически достоверные отличия от группы интактных животных. Активность КПН в них через 0,5 и 4 часа превышала соответствующие показатели нормы на 50%, p<0,01 (рис.7).

Таким образом, предварительное введение лей-энкефалин-арг способом инстилляции на конъюнктиву глаза животным перед острым ЭБС предотвращало, обнаруженное при стрессе, повышение активности КПН в гипофизе, понижение активности фермента в среднем мозге и гиппокампе, и, напротив, приводило к повышению активности фермента в стриатуме гипоталамусе и больших полушариях.

Полученные данные показывают, что при совместном воздействии острого ЭБС и предшественника лей-энкефалина изменения в активности КПН во всех исследованных регионах мозга и тканях, носят менее выраженный характер, чем при воздействии только лей-энкефалин-арг, где активность фермента повышается в 1,5-2 раза (рис.4).

3.5.2. Активность ФМСФ - ингибируемой КП при введении лей-энкефалин-арг у крыс на фоне острого ЭБС.

При введении предшественника лей-энкефалина стрессированным животным во всех исследованных отделах мозга и тканях отмечено повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП по сравнению с нормой (табл.6, рис.8). Динамика изменения активности несколько отличается от таковой для КПН. Кроме того, следует отметить, что если при воздействии острого ЭБС повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП, по сравнению с нормой, обнаружено через 72 часа, то при совместном действии двух факторов изменения такого рода отмечаются уже через 0,5 часа после начала воздействия. Затем активность ФМСФ-ингибируемой КП плавно снижается и через 24 часа приближается к норме. Через 72 часа и 10 суток активность фермента во всех отделах мозга и тканях (исключение семенники) близка к показателям интактных крыс.

Наиболее выраженное повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП по сравнению с группой интактных и стрессированных животных отмечено в гипофизе и больших полушариях (рис.8) через 0,5 часа после совместного воздействия пропептида и острого ЭБС. Активность фермента в гипофизе и больших полушариях была выше нормы на 26,5 и 26% (p<0,05) (рис.8), соответственно и превышала соответствующие показатели стрессированных животных на 46 % (p<0,05) и 38% (p<0,01) (рис.8). В другие промежутки времени статистически достоверных отличий не обнаружено, т.е. показатели активности были близки к соответствующим показателям интактных животных. Обнаруженного после воздействия острого ЭБС повышения активности КПН через 72 часа (рис.2) не отмечено (рис.8). Активность фермента в гипофизе и больших полушариях через 72 часа после совместного воздействия лей-энкефалин-арг и острого ЭБС была ниже соответствующих показателей стрессированных животных на 26% (p<0,01) и 30% (р<0,001), соответственно (рис.8).

Динамика изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП в надпочечниках при воздействии предшественника лей-энкефалина и острого ЭБС была сходной с таковой в гипофизе и больших полушариях, однако, изменения были менее выражены (рис.8). Активность фермента в них также превышала показатели животных, подверженных воздействию острого ЭБС и интактных животных через 0,5 часа на 21% (p<0,05) и 15% (p<0,05), соответственно.

В гипоталамусе, гиппокампе и семенниках при введении пропептида стрессированным животным активность ФМСФ-ингибируемой КП превышала показатели обеих сравниваемых групп через 0,5 и 4 часа, 0,5 часа и 4, 24 и 72 часа, соответственно (рис.8).

Введение лей-энкефалин-арг перед началом стресса вызывало существенное по сравнению с стрессированными животными повышение активности в среднем мозге через 0,5 и 4 часа на 41% (p<0,01) и 24% (p<0,05), соответственно (рис.8). Активности фермента при этом практически не отличалась от интактных животных (рис.8).

Сходная тенденция наблюдалась в стриатуме, здесь активность ФМСФ-ингибируемой КП через 0,5 часа превышала соответствующие показатели группы животных, подвергавшихся воздействию острого ЭБС на 32%, p<0,05 и не отличалась от нормы во все исследуемые промежутки времени. Введение предшественника лей-энкефалина предотвращало обнаруженное при стрессе повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП в стриатуме через 72 часа (рис.8).

Таким образом, практически во всех исследованных регионах мозга введение лей-энкефалин-арг перед острым ЭБС вызывало повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 0,5 часа, по сравнению с соответствующими показателями стрессированных животных и предотвращало повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 72 часа. Активность фермента при этом была близка к норме.

Данные исследований показывают, что во всех исследованных отделах мозга и тканях активность ФМСФ-ингибируемой КП при совместном воздействии стресса и лей-энкефалин-арг (рис.8) была ниже соответствующих показателей активности фермента животных, которым инстиллировался предшественник пептида (рис.5).

3.5.3. Активность АПФ при введении лей-энкефалин-арг у крыс на фоне острого ЭБС.

Полученные данные об изменение активности АПФ при введении лей-энкефалин-арг стрессированным животным представлены в таблице 7 (приложение) и на рис. 9.

Результаты исследования показывают, что при предварительном введение проэнкефалина статистически достоверные отличия от группы интактных животных обнаружены только в гипофизе. Показатели активности АПФ при этом выше таковых у интактных животных через 24 часа на 36%, p<0,05 (рис.9).

При сравнении изменений активности АПФ при совместном действии лей-энкефалин-арг и острого ЭБС с соответствующими показателями стрессированных животных статистически достоверные отклонения обнаружены в гипофизе через 24 часа и в стриатуме через 4 часа (рис.9). Активность АПФ при предварительном введении лей-энкефалин-арг перед стрессом была выше показателей активности стрессированных животных на 36% (p<0,001) и 40% (p<0,05), соответственно. В другие исследованные промежутки времени статистически достоверных изменений не обнаружено.

В семенниках через 0,5 часа после введения лей-энкефалин-арг активность АПФ была ниже соответствующих показателей животных подверженных воздействию острого ЭБС на 20% (p<0,05). Однако, уже через 4 часа отмечено повышение активности АПФ по сравнению с группой стрессированных животных на 30% (p<0,01). В другие исследованные промежутки времени активность фермента сохранялась на достаточно высоком уровне и превышала показатели активности АПФ стрессированных животных через 24 часа на 23% (p<0,01) , а через 72 часа на 41% (p<0,01).

Таким образом если ЭБС в исследуемых отделах мозга практически не вызывал изменения активности АПФ, то введение лей-энкефалин-арг на фоне острого ЭБС вызывает некоторые изменения в активности АПФ в этих отделах, особенно ярко эта тенденция прослеживается в гипофизе через 24 часа, а также в стриатуме через 4 часа. Стойкая динамика увеличения активности АПФ показана также в семенниках.

Сравнение активности АПФ после введения лей-энк-арг стрессированным животным с введением этого пропептида интактным крысам показывает, что более выраженное влияние на активность фермента предшественник лей-энкефалина оказывает при введении его животным, не подвергающимся стресс-воздействию.

Таким образом, введение лей-энкефалин-арг перед началом острого ЭБС вызывает повышение активности КПН по сравнению с соответствующими показателями активности стрессированных и интактных животных в стриатуме - отделе мозга, связанном преиму-щественно с синтезом регуляторных пептидов стресспротективного действия. Предварительное введение предшественника лей-энкефалина предотвращало повышение активности КПН в гипофизе - отделе, где синтезируются стресс-пептиды.

Введение лей-энкефалин-арг перед острым ЭБС вызывало повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 0,5 часа, по сравнению с соответствующими показателями стрессированных животных и предотвращало повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 72 часа. Особенно ярко такая тенденция прослеживается в тех отделах мозга и тканях, где осуществляется синтез биологически активных пептидов, проявляющих выраженную антистрессорную активность. Активность ФМСФ-ингибируемой КП при этом была близка к норме.

Аргинизированный лей-энкефалин влиял на активность АПФ головного мозга, надпочечников и семенников стрессированных животных в гораздо меньшей степени, чем на активность КПН и ФМСФ-ингибируемой КП. Наибольшее влияние пептида обнаружено в семенниках.

Обнаружено, что введение лей-энкефалин-арг интактным и стрессированным животным вызывает различные по степени выражен-ности и направленности изменения активности изучаемых ферментов. Наиболее значительные изменения активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ обнаружены у животных, не подвергавшихся воздействию стресса.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В настоящее время одной из наиболее актуальных проблем биохимии, физиологии и медицины является изучение молекулярных механизмов возникновения и развития стресса. Особую значимость при этом приобретает изучение острого стресс-воздействия на организм, поскольку именно кратковременное импульсное стрессирование приводит к экстренному повышению адаптивных способностей. Менее всего изучено влияние острого эмоционально-болевого стресса (ЭБС). Важную роль в устранении и/или ограничении стрессорных нарушений играет система эндогенных опиоидов [8, 14, 102, 106, 135, 236, 242]. Синтез природных опиоидных пептидов и их синтетических аналогов открыл перспективы для их использования при разного рода стресс-повреждениях организма [123]. Было показано, что выраженным антистрессорным действием обладают лей- и мет-энкефалины, лей-энкефалин-арг, синтетический аналог лей-энкефалина - даларгин [69, 105]. Несмотря на короткую продолжительность жизни экзогенных опиоидных пептидов в организме, проявляемые ими эффекты сохраняются на протяжении достаточно длительных промежутков времени [10, 11, 13, 119]. Одним из малоизученных вопросов в понимании механизмов длительного последействия экзогенных опиоидных пептидов является выяснение путей образования и инактивации других регуляторных пептидов, синтезируемых в ответ на введение опиоидов. Поскольку известно, что уровень большинства биологически активных пептидов и, следовательно, степень реализации адаптационных реакций при стресс-повреждениях организма, в значительной степени определяется активностью пептидгидролаз, то особый интерес вызывает изучение механизмов регуляции активности ферментов обмена нейропептидов при стресс-воздействии.

Исходя из вышеизложенного, интересным представляется изучение влияния экзогенного предшественника лей-энкефалина - лей5-энкефалин-арг6 на активность некоторых ферментов обмена нейропептидов - КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в норме и при воздействии острого ЭБС.

Поскольку КПН и АПФ участвуют в формировании стрессовой реакции организма, а дополнительное экзогенное введение жидкости влечет за собой возникновение стресса, то введение пропептида осуществлялось способом, который согласно данным [1, 24, 119] менее всего травмирует животное, обеспечивает более полное проникновение экзогенного вещества в мозг и позволяет использовать меньшие концентрации веществ - инстилляцией на конъюнктиву глаза.

Существенную роль в проявлении специфической активности изучаемых ферментов по отношению к регуляторным пептидам играют особенности их тканевой локализации. В связи с этим, представляется необходимым более детальное изучение регионального и тканевого распределения активности КПН, ФМСФ - ингибируемой КП и АПФ.

Максимальная активность КПН у интактных животных показана в гипофизе - отделе, где синтезируются стресс-пептиды и многие нейропептиды стресс-протективного действия (табл.1). Высокий уровень активности фермента обнаружен также в гипоталамусе, четверохолмии, стриатуме - отделах лимбической системы, богатых опиоидными и другими нейропептидами [156, 168, 169, 221, 247]. Надпочечники и семенники характеризуются низкими показателями активности КПН. Полученные данные о региональном и тканевом распределении активности КПН, хорошо согласуются с литературными [37, 187, 248]. Таким образом, полученные нами сведения о высоком уровне активности этого фермента в отделах мозга и тканях, связанных с образованием и секрецией многих регуляторных пептидов [235] подтверждают участие КПН в процессинге нейропептидов в этих регионах.

Биологическая роль ФМСФ-ингибируемой КП в организме к настоящему моменту остается неясной. Сведения о тканевом и региональном распределении ФМСФ-ингибируемой КП носят фрагментарный характер. У исследованных нами групп животных высокая активность ФМСФ-ингибируемой КП обнаружена в надпочечниках и гипофизе (табл.1). Регионы мозга характеризуются более низкими показателями, при этом активность ФМСФ-ингибируемой КП распределена достаточно равномерно. Полученные нами данные о распределении активности ФМСФ-ингибируемой КП согласуются с уровнем нейропептидов в этих структурах, что подтверждает ранее выдвигаемые предположения [49, 53, 119, 149]о вовлечении этого фермента в обмен регуляторных пептидов. Однако более конкретное определение роли этого фермента в обменных процессах остается на данном этапе открытым вопросом. В связи с вышесказанным, представляется необходимым более детальное изучение некоторых характеристик этого фермента: сравнение уровня его активности с активностью КПН - фермента, биологическая роль которого определена, а также исследование распределения активности ФМСФ-ингибируемой КП в отделах мозга и органах при различных функциональных и патологических состояниях организма.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11