Взаимодействия белков с РНК – структурный компьютерный анализ

/i>2.1.1. Метод молекулярного замещения

Для решения проблемы фаз в данной работе использовался метод молекулярного замещения. Метод основан на использовании известной структуры гомологичной молекулы (белка, РНК или ДНК) в качестве модели для получения начального приближения набора фаз [16].

Для расчета начального набора фаз необходимо, чтобы модель наилучшим образом аппроксимировала положения неизвестной молекулы в элементарной ячейке кристалла. Определение таких положений модели является основной задачей метода молекулярного замещения, которая обычно решается в два этапа. На первом этапе определяется ортогональное преобразование , обеспечивающее правильную ориентацию модели в кристаллической ячейке. На втором этапе проводится поиск вектора трансляции v, задающего положение ориентированной модели в элементарной ячейке кристалла. Чаще всего, вышеупомянутое ортогональное преобразование выражается через углы Эйлера или сферические углы [37].

2.1.1.1. Функции вращения

Преобразование W можно найти путем сравнения функций Паттерсона кристалла неизвестной молекулы Px и модели Pm. Критерием соответствия ориентации модели и неизвестной молекулы служит так называемая функция вращения, которая представляет собой интеграл перекрывания функций Px(r) и Pm(Wr) в элементе объема U и имеет максимумы если системы внутренних векторов модели и неизвестной молекулы ориентированы одинаково. Существуют методы расчета функции вращения как в прямом [22] так и в обратном пространстве [37]. В случае прямого пространства функции Паттерсона Px и Pm рассчитываются в явном виде при заданном разрешении с помощью преобразования Фурье. Затем происходит вращение Pm относительно Px с заданным шагом и ищутся максимумы функции вращения:

, (1)

где область интегрирования U - как правило сферический слой с центром в начале координат, задающийся минимальным и максимальным радиусами rmin и rmax, соответственно. Радиус rmin выбирается таким образом, чтобы исключить пик функции Паттерсона в начале координат (обычно rmin  2Е), который может порождать ошибки при численном интегрировании. Радиус rmax выбирается так, чтобы включить в область интегрирования максимальное количество внутримолекулярных векторов при минимально-возможном количестве межмолекулярных [5].

Для уменьшения расчетных затрат при численном интегрировании на сетке используются только те точки, в которых функция Pm принимает наибольшие значения, а значения функции Px в этих точках рассчитываются с помощью процедуры интерполяции [22].

Применяя преобразование Фурье и теорему Парсеваля для уравнения (1) можно получить выражение для функции вращения в обратном пространстве [37]:

, (2)

где h = (h,k,l) обозначает миллеровские индексы, а WT--- транспонированную матрицу оператора W. Действие WT на |Fm(h)|2 будет в общем случае приводить к возникновению точек в обратном пространстве, которые не описываются целочисленными индексами (h,k,l). Значения |Fm(h)|2 в таких точках могут быть получены с помощью так называемой интерференционной функции G [2]:

(3)

Анализ максимумов R(W) позволяет не только выявить наиболее вероятные ориентации модели в ячейке кристалла неизвестной молекулы, но и, в случае нескольких молекул в независимой части элементарной ячейки, найти операции точечной некристаллографической симметрии, связывающие ориентации этих молекул.

2.1.1.2. Функции трансляции

Вторым этапом решения задачи молекулярного замещения является определение положения ориентированной молекулы в ячейке кристалла. Критерием соответствия положения модели и неизвестной молекулы служит функция трансляции. Существует много вариантов определения функции трансляции, в которых используются как функции Паттерсона [3, 36] так и коэффициенты корреляции между экспериментальными и расчетными амплитудами структурного фактора [20]. Функция трансляции может также включать фазовую информацию [4] и ограничения на возможную кристаллическую упаковку молекул [22]. Основной целью при этом является нахождение глобальных максимумов функции трансляции в зависимости от вектора трансляции v, описывающего положение модели в элементарной ячейке. Эта задача обычно решается с помощью процедуры поиска на сетке разбитой по компонентам вектора v.

Функция трансляции, в которой используется перекрывание между экспериментальной и расчитанной по модели функциями Паттерсона имеет общий вид:

, (4)

где Sj обозначает операторы симметрии данной группы [15].

Наличие экспериментальной фазовой информации может существенно повысить отношение сигнал-шум в пиках функции трансляции, даже если экспериментальный набор фаз содержит значительные ошибки (например, в тех случаях, когда имеется только одна изоморфная производная). В формулировке Рида и Ширбека [35] функция трансляции, включающая фазовую информацию, определяется следующим образом:

, (5)

где сx и сm - функции экспериментальной и модельной электронной плотности, соответственно.

Кроме правильной ориентации модели, к основным факторам влияющим на точность решения функции трансляции относятся качество и полнота модели и рентгеноструктурных данных, диапазон разрешений, а также критерий отбора в соответствии с которым те или иные структурные амплитуды включаются в расчет. Также как и для функции вращения, исключение слабых рефлексов из экспериментального набора данных (без заметного ущерба для полноты набора) может несколько снизить уровень шума функции трансляции [7].

После того как решения функции трансляции получены их уточняют с помощью процедуры оптимизации ориентации и положения модели как твердого тела по методу сопряженных градиентов (например, процедура FIT в AmoRe [11] или RIGID_BODY в CNS [6]).

2.1.1.3. Методы 6-мерного поиска

При использовании моделей плохого качества (например, в случае низкой гомологии) или моделей описывающих лишь малую часть неизвестной структуры часто возникает ряд проблем, затрудняющих решение задачи молекулярного замещения обычными методами. Значительные ошибки функции вращения, неизбежно возникающие в таких случаях, усугубляют собственные ошибки функции трансляции и приводят либо к полному отсутствию правильных решений, либо к тому, что эти решения оказываются среди максимумов, лежащих на уровне шума и нет достоверных критериев позволяющих однозначно выделить их среди прочих.

Единственным на сегодняшний день общим подходом, позволяющим решать вышеперечисленные проблемы и до определенной степени расширить границы применимости метода молекулярного замещения, является отказ от разделения задачи на поиск решений функций вращения и трансляции и применение процедуры 6-мерного поиска с одновременным варьированием как углов Эйлера (б,в,г), так и компонент вектора трансляции (vx,vy,vz). Но, несмотря на значительный прогресс вычислительной техники, ни в одной из существующих программ, включая самые современные, 6-мерный поиск не проводится напрямую, как систематический поиск на 6-мерной сетке. Таким образом, ни одна из существующих программ не гарантирует нахождения абсолютных максимумов объединенной функции вращения-трансляции.

Не так давно, двумя группами независимо были предложены стохастические алгоритмы 6-мерного поиска, которые позволили создать программы, ставшие стандартным инструментом в рентгеновской кристаллографии макромолекул:

1) В работе Киссинджера и др. [26] был применен так называемый эволюционный алгоритм, который принадлежит к семейству алгоритмов стохастической оптимизации, включающему такие методы как Монте-Карло [28] и медленный отжиг [25].

2) Генетический алгоритм, независимо предложенный Чангом и Льюисом [14], основан на том же самом принципе, что и эволюционный и отличается от последнего лишь некоторыми деталями реализации. Подобный подход применялся также для разработки процедуры поиска положений тяжелых атомов в тяжелоатомных производных кристаллов макромолекул [13] и в прямых методах расчета фаз для кристаллов вирусных частиц [29].

Эволюционный алгоритм использует принцип естественного отбора для нахождения оптимальных решений. Вначале генерируется набор случайных решений, задающих одновременно и ориентацию и положение модели в элементарной ячейке. Затем рассчитываются структурные факторы Fm для каждого решения и производится отбор лучших решений исходя из коэффициента линейной корреляции [26].

Отобранные решения сохраняются и используются для создания нового набора с тем же количеством элементов, что и в предыдущем. Недостающие элементы нового набора получают, внося в ориентации и положения отобранных решений случайные изменения в соответствии с нормальным распределением. Таким образом, плотность распределения элементов нового набора уже не будет равномерной, а будет иметь максимумы в окрестностях отобранных решений. Затем снова происходит расчет структурных факторов Fm, отбор лучших решений, создание следующего набора, и так далее, пока не будет получено решение с некоторым оптимальным значением коэффициента линейной корреляции. На последней стадии, для лучшего отобранного решения проводится оптимизация ориентации и положения модели как твердого тела по методу сопряженных градиентов [33].

Скорость 6-мерного поиска с использованием эволюционного алгоритма значительно увеличивается за счет применения метода непрерывных преобразований структурных факторов [14, 26]. В этом методе структурные факторы рассчитываются один раз с помощью быстрого преобразования Фурье (FFT) для модели, помещенной в начало координат искусственной ячейки симметрии P1. В ходе 6-мерного поиска, изменение ориентации модели учитывается путем ортогональных преобразований индексов обратной решетки и использования линейной интерполяции в обратном пространстве. Изменение положения модели учитывается применением соответствующих фазовых сдвигов. При этом, принимаются во внимание вклады всех симметрически связанных молекул.

Одной из серьезных проблем, возникающих при уточнении фаз, полученных методом молекулярного замещения, является так называемая “model-bias” проблема [34]. Эта проблема проявляется в том, что если часть модели не соответствует реальной структуре, то на карте электронной плотности, рассчитанной по модели, данный участок будет в большей степени соответствовать модели чем реальной структуре. Традиционно, эта проблема решается с помощью OMIT карт электронной плотности, рассчитанных по модели, из которой исключен интересующий участок. С введением Брюнгером в программу CNS [6] возможности модификации электронной плотности рассчитанной по модели, появился еще один способ решения этой проблемы.

Таким образом, метод молекулярного замещения представляет собой мощный инструмент в кристаллографии макромолекул, который в случае высокой гомологии позволяет быстро и эффективно решать фазовую проблему. По мере того как количество известных структур макромолекул неуклонно растет, метод молекулярного замещения становится все более и более актуальным.

2.1.2. Сбор и обработка дифракционных данных

Сбор дифракционных данных комплекса S15-16SрРНК (S15 T3C мутант) проводился на синхротроне ESRF (Гренобль, Франция), линия ID14 С использованием детектора Mar CCD (= 0.93300 Е; Т=100К).

Полученные данные обрабатывали программами DENZO и SCALEPACK. Обработка данных имеет ряд этапов:

1) Выделение сильных рефлексов;

2) Предсказание обратной решётки;

3) Определение пространственной группы и параметров ячейки;

4) Уточнение параметров кристалла и детектора;

5) Обработка всех имеющихся изображений;

6) Приведение рефлексов к общей шкале;

7) Интегрирование рефлексов по всему обратному пространству.

В результате мы получили набор дифракционных данных в обратном пространстве.

2.1.3. Решение проблемы фаз

Первоначальный набор фаз получен с помощью метода молекулярного замещения. Основой для модели послужила структура с заменой Met на SeMet комплекса S15(I11M+A79M)-16SрРНК.

Для решения задачи молекулярного замещения использовалась процедура оптимизации ориентации и положения модели как твердого тела по методу сопряженных градиентов. Расчеты проводились с помощью программы комплекса CNS RIGIT-BODY REFINEMENT. Полученный R-фактор (0,339), показал, что при общей гомологии комплексов (99%) всё же наблюдается расхождение в боковых цепях и петлях.

2.1.4. Построение и уточнение модели

Первоначально были проведены несколько циклов автоматического (программой CNS) кристаллографического уточнения, которое включало в себя молекулярно-динамическую процедуру моделированного отжига (ANNELING), проводимую во внутренних координатах; уточняемыми параметрами были торсионные углы. При этом использовались ограничения (типа “restraints”) в соответствии с операцией некристаллографической симметрии.

Затем были получены две карты электронной плотности:

1) карта, рассчитанная с использованием коэффициентов 2fo-fc, где fo - структурный фактор, полученный экспериментально на основе дифракционных данных, fc - структурный фактор, рассчитанный на основе модели

2) composit-omit map - разностная 2fo-fc карта, где fc определяется как комбинированная величина, рассчитанная по нескольким моделям с исключением 5% атомов на каждом шаге.

Полученные карты были хорошего качества, что позволило вписать все боковые остатки белка, уточнить положение главной цепи и молекулы РНК. Для ручной правки использовалась программа молекулярной графики О.

Окончательное уточнение включало уточнение параметров длин связей и углов с помощью программы MINIMIZE (CNS), уточнение В-факторов для индивидуальных атомов, а так же проверку стереохимии полученной структуры и расстояний между атомами (водородные связи, Ван-дер-Вальсовы взаимодействия, «плохие» расстояния).

Окончательная модель, уточненная до значений R-фактора ***8% и Rfree ***% при разрешении до 2,8, включает ** аминокислотных остатков и ** нуклеотидов. Кроме того были локализованы *** молекул воды, ** ионов ионов Mg+2 в независимой части элементарной ячейки. Общее число атомов модели в независимой части элементарной ячейки составило ****. Модель обладает хорошими стехиометрическими параметрами и не содержит остатков, расположенных в запрещенных областях карты Рамачандрана. Часть окончательной 2Fo-Fc карты электронной плотности на уровне 1.5  показана на рис. 20. Структура комплекса S15-16SрРНК схематически показана на рис. 21. Координаты атомов окончательной модели комплекса S15-16SрРНК занесены в RCSB Protein Data Bank (код ****).

2.2. Результаты и их обсуждение

В результате проделанной работы была построена модель структуры комплекса S15-16SрРНК (S15 T3C мутант).

Модель была уточнена до R-фактора 24,5% и Rfree 30,9% при разрешении до 2,9, и включает 86 аминокислотных остатков и 57 нуклеотидов. Общее число атомов модели в независимой части элементарной ячейки составило 1943. Модель обладает хорошими стехиометрическими параметрами и не содержит остатков, расположенных в запрещенных областях карты Рамачандрана.

Таблица 2.2.1. Статистика уточнения структуры комплекса комплекса S15-16SрРНК (S15 T3C мутант)

Пространственная группа	Р6422
Параметры ячейки ()	a=128.228, b= 128.2286, c=64.9505
Длина волны ()	0,933
Разрешение ()	500 - 2,9
Избыточность	5,9
Полнота набора (%)	98,0
Rsym (%)	3,1
Rcryst/Rfree (%)	24,5/30,9
Разрешение ()	6,0 - 2,9
Число рефлексов	8209
Вср ()	44,8
R.m.s.d. связей ()	0,006
R.m.s.d. углов ()	1,2

Как видно из рисунка 2.2.1., белок S15 относится к семейству -спиральных белков и состоит из четырёх -спиралей, взаимодействующих с 16SрРНК и стабилизирующих данную структуру.

Фрагмент 16S рРНК из T.thermophilus (рис. 2.2.2.) длиной 57 нт состоит из укороченных спиралей Н20, Н21 и Н22. Спираль Н22 стыкуется со спиралью Н21, образуя вытянутую структуру, а спираль Н20 прилегает к ней под углом примерно в 60.

рис.2.2.1. Структура белка S15 (T3C мутант)

рис. 2.2.2. Структура фрагмента 16S рРНК

Белок S15 распознаёт на поверхности РНК два удалённых участка, один из которых располагается в верхней части спирали H22, а другой - в районе соединения трёх спиралей РНК (рис. 2.2.3.). Участки отстают друг от друга на один виток спирали.

рис.2.2.3. Структура комплекса S15-16SрРНК (S15 T3C мутант)

Выводы:

1. Получен и обработан набор дифракционных данных для комплекса S15-16SрРНК (S15 T3C мутант).

2. Методом молекулярного замещения определена структура комплекса.

3. Показано, что рибосомный белок комплекса S15 связывается с 16S рРНК в двух пространственно удалённых участках.

4. Показано, что мутация Т3С не изменяет пространственной структуры комплекса и структуры РНК-белкового интерфейса.

Список литературы:

1. Серганов А.А. (1997) Изучение РНК-связывающих свойств рибосомного белка S15 из Thermus thermophilus. Диссертация, МГУ.

2. Anston A.A., Otridge J., Brzozowski A.M., Dodson E.J., Dodson G.G., Wilson K.S., Smith T.M., Yang M., Kurecki T., Gollnick P. (1995). Biochemestry. 18: 693-700

3. Argos P. & Rossmann M.G. (1980) in “Theory and Practice of Direct Methods in Crystallography” (Ladd and Palmer, eds.), pp.361-417. Plenum, New York.

4. Bentley G.A. & Houndusse A. (1992), Acta Cryst. A48, 312-322.

5. Blundell T.L. & Johnson L.N. (1974) Protein Crystallography. Academic Press, New York.

6. Brunger A.T., Adams P.D., Clore G.M., DeLano W.L., Gros P., Grosse-Kunstleve R.W., Jiang J., Kuszewski J., Nilges M., Pannu N.S., Read R.J., Rice L.M., Simonson T., Warren G.L. (1998) Crystallography & NMR System: A New Software Suite for Macromolecular Structure Determination. Acta Cryst. D54, 909-921.

7. Brunger A.T., Milburn M.V., Tong L., de Vos A.M., Jancarik J., Yamazumi Z., Nishimura S., Ohtsuka E., Kim S.-H. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4849-4853.

8. Burd C.G. Dreifuss G. (1994). Conserved structures and diversity of functions of RNA-binding proteins. Science 265: 615-620

9. Bycroft M., Grunert S., Murzin A., Proctor M., Johnston D. (1995). NMR solution structure of a dsRNA binding domain from Drosophila staufen protein reveals homology to the N-terminal domain of ribosomal protein S5. EMBO J. 14: 3563-3571

10. Bycroft M., Hubbard T.J.P., Proctor M., Freund S.M.V., Murzin A. (1997). The solution structure of the S1 RNA binding domain: a member of an ancient nucleic acid-binding fold. Cell 88: 235-242

11. Castellano E., Oliva G., Navaza J. (1992), J. Appl. Cryst. 25, 281.

12. Cate J.H., Gooding A.R., Podell E., Zhou K., Golden B.L., Szewczak A.A., Kundrot C.E., CechT.R., Doudna J.A. (1996). RNA tertiary structure mediation by adenosine platforms. Science 273: 1696-1699

13. Chang G. & Lewis M. (1994), Acta Cryst. D50, 667-674.

14. Chang G. & Lewis M. (1997) Molecular Replacement Using Genetic Algorithms. Acta Cryst. D53, 279-289.

15. Crowther R.A. & Blow D.M. (1967), Acta Cryst. 23, 544-548.

16. Crowther R.A. (1972) in “The Molecular Replacement Method”, Int. Sci. Rev. No.13 (Rossmann M.G., ed.). Gordon & Breach, New York.

17. Draper D.E. (1995). Protein-RNA recognition. Annu. Rev. Biochem. 64: 593-620

18. Draper D.E. (1996) Ribosomal protein-RNA interactions. In Ribosomal RNA: structure, evolution, processing and function in protein biosynthesis. Eds. Zimmermann R.A., Dahlberg A.E. Boca Raton, Florida, CRC Press, 171-198

19. Franklin C., Shi J.P., Shimmel P. (1992). Overlapping nucleotide determinante for specific aminocylation of RNA. Science. 225: 1121-1125

20. Fujinaga M. & Read R.J. (1987), J. Appl. Cryst. 20, 517-521.

21. Harada Y., Lifchitz A., Berthou J., Jolles P. (1981), Acta Cryst. A37, 398-406.

22. Huber R. (1965), Acta Cryst. A19, 353-356.

23. Kjems J., Egebjerg J., Christiansen J. (1998) Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Elsevier, 237

24. Kim J.L., Nikolov D.B., Burley S.K. (1993). Co-crystal structure of TBP recognizing the minor groove of a TATA element. Nature 365: 520-527

25. Kirkpatrick S., Gelatt C.D. Jr & Vecchi M.P. (1983), Science, 220, 671-680.

26. Kissinger C.R., Gehlhaar D.K., Fogel D.B. (1999) Rapid automated molecular replacement by evolutionary search. Acta Cryst. D55, 484-491.

27. Marino J.P., Gregorian R.S., Csankovski G., Grothers D.M. (1995). Ent helix formation between RNA hairpins with complementary loops. Science 268: 1448-1254

28. Metropolis N., Rosenbluth A.W., Rosenbluth M.N., Teller A. & Teller E. (1953), J. Chem. Phys. 21, 1087-1092.

29. Miller S.T., Hogle J.M. & Filman D.J. (1996), Acta Cryst. D52, 235-251.

30. Musco G., stier G., Joseph C., Morelli M.A.C., Nilges M., Gibson T.J., Pastore A.. (1996) Thre-dimensional structure and stability of the KH domain: molecular insight into the fragile X syndrome. Cell 85: 237-245

31. Nevskaya, N., Tishchenko, S., Nikulin, A., Al-Karadaghi, S., Liljas, A., Ehresmann, B., Ehresmann, C., Garber, M., Nikonov, S. (1998) Crystal Structure of Ribosomal Protein S8 from Thermus Thermophilus Reveals a High Degree of Structural Conservation of a Specific RNA Binding Site. J.Mol.Biol. 279, 233-244.

32. Normanly J., Abelson J. (1989). TRNA identity. Annu. Rev. Biochem. 58: 1029-1049

33. Powell M.J.D. (1977), Math. Programming, 12, 241-254.

34. Read R.J. (1997) Model Phases: Probabilities and Bias. In Methods in Enzymology, 277, 110-128, Academic Press.

35. Read R.J. & Schierbeek A.J. (1988), J. Appl. Cryst. 21, 490-495.

36. Rossmann M.G., Blow D.M., Harding M.M., Coller E. (1964), Acta Cryst. 17, 338-342.

37. Rossmann M.G. & Blow D.M. (1962), Acta Cryst. 15, 24-31

38. Schindelin H., Marahiel M.A., Heinemann U. (1993). Universal nucleic acid-binding domain revealed by crystal structure og the B.subtilis major cold-shock domain. Nature 364: 164-168

39. Seeman N., Rosenberg J.M., Rich A. (1976). Sequence-specific recgnition of double helical nucleic acids by proteins. Pros. Natl, Acad. USA 73: 804-808

40. von Hippel P.H., McGhee J.D. (1972). DNA-protein interactions. Annu. Rev. Biochem. 41: 231-298

41. Weeks K.M., Crothers D.M. (1993). Major grove accessibility of RNA. Science 261: 1574-1577

Страницы: 1, 2