Влияние гипотермии на экспрессию генов

p align="left">Для экспериментов, имеющих целью понять механизмы развития морозоустойчивости, индуцированной экзогенно абсцизовой кислотой, были использованы культивируемые клетки эмбрионов озимой пшеницы. Культивируемые клетки обрабатывались 50 M абсцизовой кислоты в течение 5 дне при 23 0С для достижения максимального уровня морозоустойчивости. Возросшая морозоустойчивость обработанных экзогенно абсцизовой кислотой клеток была тесно ассоциирована со значительным накоплением в плазматической мембране полипептида с молекулярно массой 19 кДа. 19-кДа полипептидны компонент был выделен путем препаративного гель-электрофореза и далее разделен на мажорную и минорную полипептидную компоненту при помощи Трицин-SDS-PAGE. Была определена N-концевая аминокислотная последовательность AWPM-19 и при помощи PCR из библиотеки, выделенной из обработанных экзогенно абсцизовой кислотой культивируемых клеток, был выделен клон кДНК, кодирующий 18.9 кДа гидрофобный полипептид AWPM-19, с четырьмя мембранно-связываемыми доменами и щелочной точко pI. Экспрессия мРНК wpm-1 сильно индуцируется обработкой в течение нескольких часов 50 мМ абсцизовой кислоты. Эти результаты показывают, что AWPM-19 должен быть тесно связан с индуцируемым экзогенно абсцизовой кислотой увеличением морозоустойчивости у культивируемых клеток пшеницы.

6. Гены белков, связанных с процессом льдообразования

Установлено, что бактериальный ген, связанны с образованием льда, inaZ при перемещении в трансгенные растения вызывает образование ядер льда. Предварительная инкубация преобразованной ткани растения при температурах около 0 0C существенно повысила активность нуклеации льда в растениях, хотя максимальная активность нуклеации льда была достигнута только после низкотемпературно обработки продолжительностью около 48 часов. Хотя трансгенные растения содержат сходные количества мРНК inaZ как при «нормальных», так и при низких температурах, установлено, что низкие температуры необходимы для накопления белка INAZ. Предлагается, что устойчивость INAZ белка и, таким образом, активность нуклеации льда в трансгенных растениях усиливается при низкотемпературной обработке.

7. Гены, кодирующие белки, связанные с передачей кальциевых сигналов

Вопрос о механизме восприятия и трансформации сигнала в клетках растений к настоящему времени все еще изучен недостаточно. Установлено, что роль вторичного посредника в передаче стрессовых сигналов у различных организмов, в том числе и у растений, играют ионы Ca2+. В клетках растений, не подвергнутых действию стресса, уровень содержания Ca2+ при помощи активных Ca2+-транспортирующих систем поддерживается на низком, наномолярном уровне. Холодовой шок вызывает резкое увеличение концентрации Ca2+ в цитоплазме. На животных клетках во время стресса были показаны активации ионами Ca2+ протеинкиназы С и Ca2+-кальмодулинзависимо протеинкиназы, вызывающие изменения экспрессии генов. Для выяснения роли Ca2^ процессах ответа растения на низкотемпературны стресс и адаптации к низко температуре были проведены эксперименты по изучению влияния хелатора Ca2+ - ЭГТА и блокаторов кальциевых каналов - La3+ и верапамила - на процессы адаптации растени люцерны к холоду. Результаты экспериментов показывают, что ЭГТА ингибирует низкотемпературную адаптацию на 70%, а La3+ и верапамил полностью блокируют развитие процесса низкотемпературно адаптации у люцерны.

Чтобы далее исследовать путь передачи сигнала, который стимулирует ответ на холодовой шок у кукурузы, был выделен кодирующий низкотемпературно-индуцируемую кальций -зависимую протеинкиназу клон кДНК. Эксперименты по изучению динамики ответа на стресс показали, что низкотемпературная индукция Zmcdpk1 предшествует аналогичному показателю для mlip15, другого холодоиндуцируемого гена, кодирующего ДНК-связывающий белок типа ле цин-зиппер, что указывает на то, что Zmcdpk1 может размещаться раньше mlip15 в пути передачи вызванного холодным стрессом сигнала. При этом было отмечено, что уровень mlip15 мРНК в конститутивном состоянии в большой степени возрос после обработки циклогексимидом. Кроме гена mlip15, циклогексимид увеличивает уровни транскрипции двух других индуцируемых низко температуро генов -Zmcdpk1 и Adh1, кодирующего алкогольдегидрогеназу 1. Напротив, экспрессия гена хальконсинтетазы индуцировалась только низко температуро. Аккумуляция транскриптов mlip15 при низких температурах и в ответ на циклогексимид значительно уменьшалась после предварительно обработки хелатором кальция, что позволяет предполагать, что кальций вовлечен в обоих случаях индукции гена mlip15.

После холодового шока усиливается экспрессия TCH-генов из Arabidopsis, которые кодируют калмодулин-связанные белки и ксилоглюкан эндотрансглюканазу. Была исследована возможная роль колебаний во внутриклеточных концентрациях иона кальция Ca2+ в вызванно холодовым шоком экспрессии гена TCH. Для этого у трансгенных растени, несущих ген апоэкворина, был проведен мониторинг содержания Ca2+ с тем, чтобы исследовать необходимость индуцируемого холодом увеличения содержания Ca2+ для экспрессии TCH. Индуцированное холодовым шоком увеличение содержания Ca2+ может быть заблокировано La3+ и Gd3+, предполагаемыми ингибиторами Ca2+-канала в плазматической мембране, и 1.2-бис этан-н,н-тетраацетиловой кислотой, внеклеточным хелатором Ca2+. В ходе экспериментов было установлено, что индуцируемая холодовымшоком экспрессия TCH генов затормаживается высокими уровнями содержания всех этих агентов, что, как было показано, блокирует увеличение содержания Ca2+. Эти данные подтверждают то, что внутриклеточное увеличение содержания Ca2+, следующее за холодовым шоком, требует внеклеточного Ca2+ и может получить необходимы приток Ca2+ опосредованно через Ca2+ каналы плазмалеммы. Во-вторых, результаты экспериментов свидетельствуют, что индуцируемая холодом экспрессия хотя бы подкласса TCH-генов требует увеличения содержания внутриклеточного Ca2+.

8. Гены белков холодового шока

Установлено, что у бактерий существует многочисленное семейство генов, экспрессирующихся только в ответ на резкое снижение температуры. Гены этого семейства обозначены как гены белков холодового шока. Показано, что для начала экспрессии некоторых из этих белков холодового шока бактерий достаточно снижения температуры на 10 - 150С.

Известно, что экспрессия гена CspA, важнейшего белка холодового шока Escherichia coli, очень сильно индуцируется во время резкого снижения температуры. Установлено, что замена трех оснований около последовательности Shine-Dalgarno размером в 159-оснований в 5'-нетранслируемой области мРНК cspA стабилизирует мРНК, приводя к конститутивному синтезу CspA при 370С. Как оказалась, эта стабилизация, по крайне мере частично, происходит из-за сопротивления деградации РНКазо E. Холодовая индукция cspA также достигалась путем замены его промотора промотором Ipp, не индуцируемым-холодовым шоком. Таким образом, полученные данные указывают на то, что ген CspA эффективно транскрибируется даже при 370C. В то же время трансляция мРНК белка CSPA заблокирована вследствие ее предельно нестабильности при 370C. Представленные результаты также демонстрируют, что ген cspA конститутивной транскрибируется при всех температурах; однако его экспрессия при 370C предотвращена из-за дестабилизации его мРНК.

С целью оценить эффективность промоторов белков холодового шока для их низкотемпературно экспрессии, было сконструировано транскрипционное слияние генов между промотором гена cspA и геном бета-галактозидазы lacZ. Показано, что в таком слитом гене синтез бета-галактозидазы эффективно подавлялся при 370C, но быстро индуцировался при переносе в 150C, приводя к трех- пятикратному увеличению в специфическо активности белка относительно контрольно бактериально культуры. Только продолжение инкубации культуры при 200C, но не при 150C, приводило к ослаблению активности из-за деления клетки и репрессии промотора, хотя исходные показатели накопления бета-галактозидазы при 200C были в два раза выше измеренных при 150C.

Из двух штаммов Lactobacillus plantarum были клонированы два гена белков холодового шока, cspL и cspP. Эти гены, являющиеся неаллельными, присутствовали во всех исследованных штаммах. Данные гены кодируют полипептиды из 66-аминокислотных остатков, родственные друг другу и принадлежащие к семейству CSP - «белков холодового шока». Транскрипция гена cspP оканчивается единственной мРНК, в то время как для гена cspL были найдены две cspL мРНК с общими 5' концами. Содержание этих транскриптов умеренно возрастало в ответ на обработку культур холодом.

При изучении ответа лактозно-кислых бактерий на замораживание было установлено, что при замораживании культуры лактозно-кислых бактерий жизнеспособность клеток в значительно мере снижалась. В то же время, когда культуры бактерий перед замораживанием были предварительно подвергнуты в течение 2 часов холодовому шоку при 100C, значительно улучшалась жизнеспособность у штаммов Lactococcus lactis subsp.lactis и Pediococcus pentosaceus PO2, но она не менялась у штамма Lactococcus lactis subsp. cremoris и у штаммов Lactobacillus helveticus LB1 и Streptococcus thermophilus TS2. Жизнеспособность клеток возросла еще более, когда период холодового шока был продлен до 5 часов. Использование дегенерированных PCR пра меров, полученных как из гена важнейшего белка холодового шока Escherichia coli, так и Bacillus subtilis приводит к образованию PCR продуктов у всех изученных штаммов. PCR продукт из Lactococcus lactis ssp. Lactis M474 был клонирован и секвенирован. Вычисленная для этого белка последовательность аминокислот показала высокую гомологию с аминокислотными последовательностями других белков семе ства CSP. Использование PCR праймеров, основанных на последовательность M474, приводило к образованию PCR продуктов только у изученных штаммов лактококков, но не у изученных штаммов Lactobacillus helveticus, Streptococcus thermophilus или Pediococcus pentosaceus.

9. Гены протеинкиназ

Клон кДНК для гена рецепторо-подобно протеинкиназы был выделен из Arabidopsis thaliana. Этот клон длиной 1952 bp с открытой рамкой считывания размером 1623 bp кодирует пептид из 540 аминокислот, которы содержит четыре области, характерных для рецепторной киназы. Во-первых, он содержит характерную для киназ предполагаемую аминотерминальную сигнальную область последовательности. Во-вторых, он содержит область с пятью экстрацеллюлярными богатыми ле цином повторяющимися последовательностями. В-третьих, он имеет мембрано-связывающую область и, в-четвертых, домен цитоплазматическо протеинкиназы, который содержит все 11 субдоменов, характерных для протеинкиназ. Ген RPK1 экспрессируется в цветах, побегах, листьях и корнях. Показано, что экспрессия гена RPK1 индуцируется в течение 1 часа после обработки экзогенно абсцизовой кислотой. Ген также быстро индуцируется различными другими абиотическими стрессами, такими, как обезвоживание, высокая концентрация солей и низкая температура. Предлагается, что данный ген вовлечен в общий ответ клетки на стресс. Вызванная обезвоживанием индукция гена rpk1 не нарушается в дефицитных по эндогенно абсцизовой кислоте мутантах aba-1, abi1-1, abi2-1, abi3-1 и, вследствие этого, предполагается, что эта индукция не зависит от обработки абсцизовой кислотой.

10. Гены картофеля, индуцируемые хранением на холоду

Хранение клубне картофеля на холоду при 4 0C связано с

накоплением нескольких индуцируемых холодом транскриптов генов. Путем использования в качестве зонда ранее охарактеризованной кДНК был выделен и секвенирован соответствующий ген ci7.

Предполагаемы промотор ci7 содержит последовательность элементов, которая, как было показано, регулирует экспрессию индуцируемых холодом генов у Arabidopsis thaliana. Транскрипты CI7 дифференциальной экспрессируются в клубнях и листьях картофеля в ответ на холодовой стресс, засуху, высокую концентрацию солей или обработку экзогенно абсцизовой кислотой. В то время как накопление транскриптов CI7 во время хранения на холоду происходит в течение нескольких дне, индукция транскриптов CI7 в ответ на засуху, экзогенную абсцизовую кислоту и солевой стресс происходит быстро, в течение нескольких часов. Накопление белка CI7 в ответ на абиотические стрессы и обработку экзогенно абсцизовой кислотой в клубнях было небольшим, особенно по сравнению с уровнем содержания транскриптов. В листьях белок CI7 отсутствовал после всех исследованных воздействи. В ходе экспериментов растения S. tuberosum были трансформированы слитым с репортерным GUS-геном 5'-фланкирующим промоторным регионом ci7 размером 3 kb. Анализ клубне независимых трансгенных лини не обнаружил значительно индукции энзиматической активности GUS в ответ на низкотемпературное воздействие. В то же время, когда для анализа уровня индукции гена GUS с введенным ci7 промотором был использован РНК блоттинг, гетерологичное слияние GUS сильно индуцировалось в ответ на низкие температуры. По сравнению с РНК блот-анализом трансгенных растений, изучение ядерной «run-on» транскрипции ci7 гена показало, что большая часть температурно-регулируемо экспрессии гена ci7 в клубнях может быть связана с посттрансляционными механизмами контроля.

Анализ последовательности кДНК клона CI21, который соответствует другому индуцируемому холодом транскрипту, обнаруживает высокую гомологию с транскриптами томата и дикого картофеля, индуцируемыми созреванием и водным стрессом. Два гомологичных, неаллельных гена, ci21A и ci21B, были выделены и секвенированы. Нозерн-блот анализ показал, что самые высокие уровни содержания транскриптов ci21 обнаружены в хранимых в холоде клубнях. Более низкие уровни транскриптов содержатся в стеблях и корнях, и самые низкие уровни отмечены в листьях и клубнях, хранимых при комнатной температуре. Обработка растений абсцизовой кислотой, высокая концентрация соли и тепловой шок не оказывали значительного влияния на уровни содержания транскрипта ci21 в клубнях и листьях. Подсушивание было единственным стрессом, вызывавшим транскрипцию CI21 на листьях, но оно не вызывало ее в клубнях. Вестерн-блот анализ обнаружил белок CI21 только в клубнях. Химерный ген, созданный путем слияния предполагаемо области промотора ci21A и репортер-геном uidA, тестировался на индукцию бета-глюкуронидазы низко температуро в трансгенных картофельных растениях, при этом в ответ на хранение клубне при 4 0C у трансгенных растений наблюдалось двукратное увеличение активности бета-глюкуронидазы.

11. Гены Y-box белков и белков, регулирующих процессы транскрипции и трансляции

В ходе исследований экспрессии генов семейства Y-бокс белков, регулирующих процессы транскрипции в клетках, было установлено, что высококонсервативный элемент основы промотора grp78 играет важную роль в индукции grp78 под разнообразными стрессовыми сигналами. Предшествующее изучение установило функциональную область в 3' конце основы промотора, которая проявляет стресс-индуцируемые изменения в стрессированных ядрах. В ходе экспериментов показано, что человечески фактор транскрипции YY1 связывает SICR и трансактиваторный элемент основы промотора в условиях стресса. Скрининг библиотек с данным элементом промотора выявил два новых связывающих эту область промотора белка, YB-1 и DBPA. Оба белка принадлежат к семейству Y-бокс белков, для которых характерен эволюционно- устойчивы ДНК-связывающий мотив - домен холодового шока. В ходе исследований в экспериментах по ко-переносу было установлено, что Y-бокс белки выступают в стрессированных клетках антагонистами WI-опосредованного управляемого grp78 усиления транскрипции. Таким образом, белки, имеющие домен холодового шока, могут быть частью механизма передачи сигнала стресса у млекопитающих.

В то же время проблематично существование особых факторов транскрипции для специфических функци в элементах промотора, особенно в таких системах, как G-бокс, поскольку существуют многочисленные синергические специфические для G-бокса факторы, в частности, промотора алкогольдегидрогеназы у Arabidopsis, которы регулирует экспрессию в ответ на холодовое возде ствие и обезвоживание.

12. Гены, связанные с низкотемпературной акклиматизацией

В ходе исследований по изучению влияния низкотемпературно акклиматизации на экспрессию генов в растениях выявлено и охарактеризовано значительное число генов, экспрессия которых индуцируется во время этого процесса как в травянистых, так и в древесных растениях. Значительное число этих генов индуцируется также экзогенно абсцизово кислото и засухо. В то же время выявлены гены, которые специфичны для процесса акклиматизации растения к низким температурам и не индуцируются другими типами абиотического стресса.

Для установления молекулярных основ холодово акклиматизации у клубники было проведено выявление генов, ассоциированных с низкотемпературно акклиматизацие.

Дифференциальный скрининг библиотеки кДНК, изготовленно из акклиматизированных к холоду растений клубники, позволил изолировать различные кДНК, дифференциально экспрессирующиеся при низкотемпературно акклиматизации. Нозерн-блот анализ показал, что уровень транскриптов Fcor1 возрастал после 2 дне низкотемпературно акклиматизации, в то время как аналогичны показатель Fcor2 увеличивался только после 2 недель низкотемпературно акклиматизации. С друго стороны, уровень содержания транскриптов Fcor3 снижался в течение 24 часов воздействия низкотемпературно акклиматизации и оставался на низком уровне в течение 8 недель периода акклиматизации. Гены Fcor1 и Fcor2 экспрессируются во всех тканях, в то время как ген Fcor3 специфичен для листьев. Кодируемы геном Fcor1 белок имеет высокое содержание ле цина, изолейцина, глицина, пролина и серина. Данный белок имеет гомологию с белками, кодируемыми геном ячменя blt101, индуцируемым низкотемпературно акклиматизацие, и геном Lophopyrum esi3, индуцируемым солевым стрессом. Белок FCOR2 богат лизином, лейцином, валином, аланином и аргинином и не имеет гомологии ни с каким из продуктов известных генов. Частичны клон кДНК Fcor3 кодирует полипептид, имеющий очень высокую идентичность с субъединице V PSI из шпината и с полипептидом PSI Psag из ячменя. Уровень накопления транскриптов Fcor1 коррелирует с устойчивостью к замораживанию у исследованных сортов клубники.

Клон кДНК pbn59 был изолирован путем дифференциального скрининга библиотеки кДНК акклиматизированного к холоду озимого рапса. Нуклеотидная последовательность BN59 оказалась гомологичной последовательности, кодирующей 70 кДа субъединицу вакуолярной Н+-АТФазы в растениях. Транскрипты, гибридизующиеся с BN59, аккумулируются во время воздействия низко температуры и воздействия экзогенно абсцизовой кислоты. Вестерн-блоттинг белков также показал увеличение содержания 70 кДа субъединицы во время акклиматизации к холоду. Накопление эндомембранной Н+-АТФазы следует также из наблюдений за осмотическим регулированием, увеличением содержания эндогенно абсцизово кислоты и пролиферации эндомембран в течение холодной акклиматизации.

Двенадцать клонов индуцируемых холодом кДНК были изолированы путем дифференциального скрининга библиотеки кДНК, подготовленной из мРНК холодоустойчивого картофеля. При помощи нозерн-блот гибридизации было проанализировано накопление мРНК, соответствующей каждому клону. Изолированные в данном исследовании клоны кДНК обозначены как Ssci. Все клоны отчетливо индуцировались в ответ на холод -накопление соответствующих транскриптов было замечено уже после одного дня закаливания к холоду. Максимальная аккумуляция мРНК, соответствующих клонам Ssci1, Ssci2, Ssci6 и Ssci8, была отмечена в первы день холодового закаливания, тогда как для клонов Ssci3, Ssci4, Ssci5, Ssci7, Ssci9, Ssci10, Ssci11 и Ssci12 - после 8 дне закаливания. Частичная последовательность ДНК была определена для 5' и 3' концов клонов и был произведен поиск гомологии с последовательностями в базах данных. Результаты поиска показали, что выделенные клоны кДНК соответствуют известным генам и кодируют мРНК для следующих белков: мРНК для двух различных S-аденозил-L-метионин декарбоксилаз, два хлоропластных шаперонина, белок цикла деления клетки CDC48, малатдегидрогеназу, мио-инозитол-1-фосфат синтетазу, протопорфирин IX:Mg хелатазу, фактор элонгации EF-1a, хлоропластный фактор элонгации трансляции EF-G, рибосомальный белок L-3 и мРНК для белка томата TAS14, индуцируемого экзогенно абсцизовой кислото. Выявленные гены могут участвовать в двух различных механизмах, относящихся к холодоустойчивости. Одна группа может предохранять хлоропласты и клеточные структуры во время стресса, в то время как другая может быть вовлечена в механизмы приспособления растительной клетки к холоду

Были изучены некоторые из ответов мутантов Arabidopsis thaliana L., не развивающих максимальной холодостойкости после холодовой акклиматизации, на холодовое воздействие. В ходе экспериментов были изучены холодовая индукция трех белков, уровни содержания сахарозы и глюкозы, жирнокислотный состав липидов, а также накопление антоцианинов в листьях. Четыре мутации понижали или устраняли накопление антоцианина во время холодно акклиматизации. Одна мутация предотвращала индуцируемое холодом в норме повышение уровня содержания сахарозы и глюкозы. Мутации sfr4 и sfr7 влияли на жирнокислотный состав липидов после холодовой акклиматизации. С другой стороны, поскольку все исследованные параметры у мутаций sfr1, sfr2 и sfr5 не отличались от таковых у дикого типа, то предполагается, что они имеют другое, вполне возможно, высокоспецифическое действие в ответ на низкотемпературное воздействие.

Регулируемый холодом оперон rbpA1-rpsU кодирует РНК-связывающий белок и рибосомальный белок M3 у Anabaena variabilis. Уровень экспрессии этой группы генов примерно в десять раз выше при температурах ниже 30 0C, чем при 38 0C. С целью изучения функций белка RbpA1 in vivo был создан нарушенный вставкой ген rbpA1. Эти мутанты были полностью лишены белка RbpA1, но содержали нормальны уровень продукта гена rpsU - рибосомального белка S21. При 38 0C мутанты были морфологически нормальными, но при 22 0C они с небольшой частотой производили необычные клетки. По-видимому, эти клетки были на начальном этапе образования прогетероцист. В присутствии нитрата при 22 0C у мутантов на молекулярном уровне также происходили различные события, обуславливающиеся инициацией превращения в гетероцисты, а именно, иссечение 11-kbp элемента ДНК в nifD и накоплении копи xisA и hetR, но в то же время эти события не происходили в присутствии аммония или при 38 0C. Полученные результаты позволяют считать, что RbpA1 необходим для полно репрессии инициации образования гетероцист при низких температурах в присутствии нитрата.

В ходе изучения низкотемпературного ответа генома Arabidopsis thaliana были охарактеризованы две связанные кДНК, соответствующие генам, экспрессия которых временно индуцируется низкими температурами. RCI2A и RCI2B кодируют небольшие сильно гидрофобные белки, которые несут два потенциальных трансмембранных домена. Анализ их аминокислотно последовательности показал сродство с регулируемыми различными стрессовыми условиями белками, кодируемыми генами из ячменя и Lophophyrom elongatum. Их высоки уровень гомологии последовательностей и их геномная локализация в отдельном рестрикционном фрагменте подтверждают то, что оба гена появились в результате тандемной дупликации. В то же время их регулирующие последовательности достаточно различаются для того, чтобы считать их различными генами. Подобно большинству охарактеризованных индуцируемых холодом генов растений, экспрессия RCI2A и RCI2B также усиливается экзогенно абсцизовой кислотой и дегидратацией, но не обще реакцией растения на стрессовые условия, поскольку она не индуцируется солевым стрессом или анаэробиозом. Более того, низкая температура способна вызвать экспрессию RCI2A и RCI2B в ABA-дефицитной и нечувствительной генетической среде, что свидетельствует о том, что низкотемпературны ответ этих двух генов регулирует и зависимые от абсцизово кислоты, и независимые от нее пути.

Для изучения генетического регулирования морозоустойчивости рапса у популяции F2 Brassica rapa и двойно гаплоидно популяции Brassica napus in vitro определялась относительная морозоустойчивость акклиматизированных и неакклиматизированных растений. Для идентификации предполагаемых локусов количественных признаков использовались разработанные раньше карты связе. У популяции B. napus области генома со значительным влиянием на морозоустойчивость не были обнаружены, но у B. rapa четыре области ассоциировались со связанно с акклиматизацией морозоустойчивостью и способностью к акклиматизации, но две другие области связывались с морозоустойчивостью, не связанно с акклиматизацией. Способность к акклиматизации регулировалась генами с очень небольшими как положительными, так и отрицательными эффектами доминирования. Аллель озимых родителе имела положительные добавочные эффекты, но отрицательные доминантные эффекты в локусах количественных признаков FTN. RFLP локусы обнаруживались при помощи индуцируемо холодом и связанно со стрессом кДНК из Arabidopsis thaliana, картированно около двух локусов количественных признаков для FTA/FTB.

Недавние исследования определили в растениях cis-действующий ДНК-регулирующий элемент, «C-повтор/отвечающий на обезвоживание элемент », которы стимулирует транскрипцию в ответ на де ствие низко температуры и водного дефицита. Из Arabidopsis thaliana была выделена кДНК, которая кодирует «C-repeat/DRE» связывающий фактор, CBF1. Анализ выведенной аминокислотной последовательности CBF1 показывает, что белок имеет молекулярную массу 24 кДа, потенциальную ядерную локализацию последовательности и возможную активность в кисло области. CBF1 также имеет область AP2, которая является ДНК-связывающим мотивом из 60 аминокислот, имеющимся в белках Arabidopsis APETALA2, AINTEGUMENTA, и TINY и в других растительных белках с неизвестными функциями. Уровни содержания транскриптов CBF1, которые конститутивной являются единичными или низкими, незначительно изменялись в растениях, подвергнутых низкотемпературно обработке, или в отдельных листьях, подвергнутых дефициту воды. Связывание CBF1 к «C-repeat/DRE» продемонстрировано при помощи анализа со сдвигом геля при использовании рекомбинантного белка CBF1, экспрессированного в Escherichia coli. Кроме того, обнаружено, что экспрессия CBF1 в дрожжах активизирует транскрипцию репортер-генов, содержащих «C-repeat/DRE» как активизатор, расположенный выше последовательности, но не активизирует транскрипцию мутантно версии элемента ДНК. Считается, что CBF1 может функционировать как активизатор транскрипции, который связывается с «C-repeat/DRE» ответственным элементом ДНК и, вероятно, играет роль в индуцированной холодом и обезвоживанием экспрессии гена у Arabidopsis.

Из обработанных холодом проростков холодоустойчивого сорта сои при помощи дифференциального секвенирования были выделены две регулируемые холодом кДНК - src1 и src2. Уровень содержания транскриптов src1 увеличивается после воздействия низкой или высокой температурой, засухой, ранением и инфекцие вирусом мозаики соевого боба. Транслированный из кДНК src1 полипептид имеет 102 аминокислоты, гидрофилен и имеет девять аминокислотных повторов, богатых глютаминовой кислотой, гистидином, лизином и глицином. SRC1 имеет гомологию с белком водного стресса риса и регулируемым холодом белком люцерны. Уровень содержания транскриптов src2 увеличивался только после понижения температуры до 50C, что указывает на то, что этот ген индуцируется только охлаждением. Транслированны из кДНК src2 полипептид состоит из 290 аминокислот и содержит семь повторов последовательностей аминокислот, богатых пролином, глицином, тирозином и глутамином и гидрофобную область у карбокси-конца, которая может связываться с мембраной. Уровень транскриптов src2 при 50C продолжал увеличиваться вплоть до 48 часов де ствия низко температуры в холодоустойчивом сорте Kitamusume, в то время как он достигал максимума через 12 часов и затем понижался в чувствительном к холоду сорте Koganejiro.

Из Arabidopsis thaliana был изолирован геномный фрагмент EcoRI размером 7 kb, которы содержит два тесно связанных dhn/lea/rab-подобных гена - lti29 и cor47 в тандемном оформлении. Для обоих транскриптов показана аккумуляция в ответ на низкотемпературны стресс, обработку экзогенно абсцизово кислото и обезвоживание. Сравнение последовательносте аминокислот транслированных полипептидов показало, что они на 67% идентичны. Рассчитанные молекулярные массы этих полипептидов были 29 кДа для

LTI29 и 30 кДа для COR47. Оба полипептида содержат один консервативны сериновый домен и три богатых лизином повтора, как у DHN/LEA/RAB-подобных белков. Кроме того, как LTI29, так и COR47 имеют N-терминальный кислый повтор, обнаруживаемый только у нескольких среди DHN/LEA/RAB белков. Близкое расстояние между двумя генами и их тандемная организация в геноме A. thaliana, а также общая гомология последовательности области кодирования на нуклеотидном уровне позволяют предположить, что два гена развились путем дублирования. Это, по-видимому, представляет собой общую черту среди зависимых от низкотемпературного стресса генов A. thaliana.

Paldi с соавторами был изучен эффект низко температуры на процессинг рРНК у пшеницы. Две линии пшеницы, использованные в это работе, отличались друг от друга только морозоустойчивостью. В ходе экспериментов было показано, что в случае слабоморозоустойчиво линии количественные и качественные изменения в процессе созревания рРНК произошли как результат де ствия низко температуры. В течение холодово обработки последние предшественники двух стабильных цитоплазматических рРНК накапливались в качестве стабильных фракций рРНК. Это накопление увеличивалось по мере увеличения продолжительности холодовой обработки. В то же время это изменение не было выявлено у линии с хороше морозоустойчивостью. Результаты свидетельствуют, что в слабоморозоустойчивых линиях холодовая обработка имела ингибирующи эффект на последнюю стадию процесса созревания рРНК, то есть при низко температуре этот процесс не может завершиться.

Известно, что тепловая обработка плодов помидора индуцирует также и устойчивость к повреждению от охлаждения. Ранее было показано, что специфические белки теплового шока экспрессируются в нагретых плодах помидора после хранения на холоде. Для поиска индуцируемых теплом генов, экспрессирующихся при низких температурах, была изготовлена, а затем подвергнута дифференциальному скринингу библиотека кДНК из предварительно прогретых, а затем охлажденных плодов помидора. В ходе этих экспериментов был выделен новы клон кДНК, hcit2, кодирующий белок с молекулярно массой 16.5 кДа. Кодируемы им белок содержит три предполагаемых трансмембранных гидрофобных последовательности, что позволяет предполагать, что этот белок локализован в мембранах. Экспрессия hcit2 в плодах индуцировалась высоко температурой, но не иными видами стресса, такими, как, например, низкая температура, засуха или анаэробные условия, и не наблюдалась во время созревания плода. Высокий уровень транскриптов hcit2 был обнаружен в нагретых плодах после 2-х недель хранения при 20C. Высокие температуры также индуцировали экспрессию hcit2 в листьях, цветах и стеблях помидора. Авторы предполагают, что белок HCIT2 может быть вовлечен в процесс приобретения растением устойчивости к повреждению охлаждением.

У ряда лини дикого картофеля были проанализированы динамика холодового закаливания и изменения в транслируемых мРНК во время холодово акклиматизации. Перед низкотемпературно обработкой все линии были полностью закалены в течение восьми дне при 40C. Наиболее холодостойкая линия 1 усилила холодостойкость от -3,20C до - 8,90C, а наименее холодостойкая линия 10 увеличила свою холодостойкость от -2,50C до -6,50C. В ходе исследований были изолированы поли-РНК из закаленных и незакаленных растений лини 1 и 10 и продукты их трансляции in vitro были разделены двумерным-PAGE-электрофорезом. Анализ профилей продуктов трансляции in vitro закаленных растений линии 1 обнаружил изменения в содержании приблизительно 31 продукта в области молекулярных весов от 14 до 69 кДа и pI в районе от 6,7 до 5,0. Содержание 26 продуктов во время холодно акклиматизации повышалось, а двух других белков - уменьшалось. Во время, когда растения подвергались низкотемпературному стрессу, было возможно идентифицировать вновь образующиеся продукты трансляции - три с мол. массами около 18 кДа и два с мол. массами около 45 кДа. Большинство продуктов, содержание которых изменялось в течение холодовой акклиматизации, было обнаружено в группе низкомолекулярных белков с молекулярными массами от 14 до 21 кДа и от 24 до 35 кДа. В менее устойчиво линии 10 в течение холодовой акклиматизации изменялось содержание только 19 продуктов трансляции, и в ней не было отмечено вновь образующихся продуктов. Все изменения в продуктах трансляции в обеих линиях появлялись после двух дне холодовой обработки, когда морозоустойчивость линий еще повышалась.

Таким образом, к настоящему времени накоплено большое количество данных об отдельных индуцируемых низкой температурой генах у различных видов растений. Особенно большой объем данных в настоящее время получен в связи с проводимым полным сиквенсом генома Arabidopsis thaliana. В то же время необходимо отметить, что, несмотря на обилие данных о влиянии низко температуры на экспрессию генов в растениях, эти исследования проводятся отрывочно и бессистемно. В основном, полученные данные говорят об индукции экспрессии определенных генов низко температурой. В то же время данные о взаимосвязи экспрессии различных генов при низкотемпературном стрессе крайне ограничены. Все же из рассмотренных выше данных можно сделать вывод, что, хотя по сравнению с «нормальными» температурными условиями содержание ДНК при гипотермии меняется незначительно, в то же время гипотермия вызывает значительные изменения в экспрессии генов на уровне транскрипции. При низкотемпературном стрессе и в процессе низкотемпературно адаптации у разных исследованных видов индуцируется экспрессия ряда генов, некоторые из которых являются видоспецифичными. В то же время выделено несколько семейств генов, которые индуцируются в ответ на низкотемпературны стресс у многих из исследованных видов. Установлено, что многие из экспрессирующихся при низко температуре генов индуцируются также в ответ на обработку экзогенно абсцизово кислото и засуху. Индукция некоторых генов является общим неспецифическим ответом организма на стресс, так как они индуцируются всеми изученными видами абиотического и биотического стресса. Поскольку установлено, что низкотемпературны стресс вызывает изменения экспрессии генов на уровне транскрипции, можно пере ти к рассмотрению результатов, полученных при изучении его влияния на уровне трансляции.

Страницы: 1, 2