Уровень вещества Р и активность ферментов обмена регуляторных пептидов в сыворотке крови спортсменов при физической работе

Уровень вещества Р и активность ферментов обмена регуляторных пептидов в сыворотке крови спортсменов при физической работе

Федеральное агентство по образованию

Пензенский государственный педагогический университет

им. В.Г. Белинского

Факультет

Естественно-географический

Кафедра

Биохимии

Дипломная работа

УРОВЕНЬ ВЕЩЕСТВА Р И активность ФЕРМЕНТОВ ОБМЕНА РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ В СЫВОРОТКЕ крови спортсменов ПРИ ФИЗИЧЕСКОЙ РАБОТЕ

Студент

________________________ Дашкевич Д.В.

Руководитель

_________________________ Соловьев В.Б.

К защите допустить.

Протокол № от «____» ___________200_г.

Зав. кафедрой

__________________________ Генгин М.Т.

Пенза, 2009г.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Вещество Р

1.2 Ферменты обмена регуляторных пептидов

1.2.1 Карбоксипептидаза N

1.2.2 Пептидил-дипептидаза А

1.2.3 Лейцинаминопептидаза

1.3 Механизм адаптации к физической работе. Роль регуляторных пептидов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы исследования

2.2 Методы исследования

2.2.1 Моделирование физической работы

2.2.2 Метод определения концентрации вещества P

2.2.3 Метод определения активности КПN

2.2.4. Метод определения активности ангиотензинпревращающего фермента

2.2.5 Метод определения активности лейцинаминопептидазы

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений

АД - артериальное давление

АКТГ - адренокортикотропный гормон

АПФ - ангиотензинпревращающий фермент

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГЭМЯК - гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота

кбз- - карбобензокси-

КПN - карбоксипептидаза N

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ПВДС (ДСИП) - пептид, вызывающий дельта сон (дельта-сон индуцирующий пептид

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид

ЭБС - эмоционально-болевой стресс

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

В последнее время в биохимии спорта огромное внимание уделяется поиску тех ключевых факторов регуляции метаболизма, воздействие на которые позволит значительно улучшить спортивный результат. Наиболее перспективной мишенью для воздействия является пептидергическая система. Нейропептиды играют важную роль в адаптационных процессах, участвуют в формировании пищедобывательного и полового поведения, регулируют состояние иммунной системы [2]. Многие из этих веществ вовлекаются в регуляцию полового созревания, влияют на половую дифференциацию организма, на процессы внимания и памяти, на эмоциональное поведение, обладают анальгезирующим действием. Данные исследований последних лет свидетельствуют об участии некоторых регуляторных пептидов в реакциях адаптации при физической работе. Однако, ограничения, связанные с трудностью введения регуляторных пептидов в организм животных, снижают возможности их использования для регуляции функционального состояния организма и улучшения спортивного результата. Кроме того, изучение содержания уровня того или иного нейропептида в тканях и сыворотке крови не дает достаточно точных представлений о динамических процессах, происходящих в пептидергической системе при физической работе. Более информативным является изучение процессов синтеза и трансформации нейропептидов, поскольку концентрация биологически активных пептидов зависит от активности ферментов, участвующих в их обмене.

Еще одним существенным недостатком имеющихся работ по изучению содержания регуляторных пептидов при физической работе является отсутствие дифференциации объектов исследования по уровню тренированности. Высокий спортивный результат могут показать небольшое количество специализированных людей-спортсменов высокой квалификации, а обычные люди повторить его не в состоянии. Биохимические изменения, которые его сопровождают, являются очень значительными и превосходят изменения, которые наблюдаются у обычных людей, не занимающихся спортом, как в количественном, так и в качественном отношениях.

Знание путей образования и инактивации регуляторных пептидов, участвующих в ответе организма на физическую нагрузку, позволит, избирательно воздействуя на ферменты их метаболизма, регулировать уровень биологических форм тех нейропептидов, от которых зависит спортивный результат.

Таким образом, целью нашей работы являлось выяснение роли пептидергической системы в адаптации к физической работе у спортсменов высокой квалификации.

При этом ставились следующие задачи:

1. Изучить уровень вещества Р, регуляторного пептида контролирующего многие адаптационные перестройки и обладающего широким спектром физиологического действия, в сыворотке крови спортсменов и не спортсменов в норме и при физической работе.

2. Изучить активность ферментов обмена регуляторных пептидов - пептидил-дипептидазы А, карбоксипептидазы N и лейцинаминопептидазы в сыворотке крови спортсменов и не спортсменов в норме и при физической работе.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые исследован уровень вещества Р и активность ферментов его обмена при физической работе. Полученные данные позволят приступить к разработке методов направленного влияния на активность ферментов обмена пептидов, участвующих в адаптации к физической работе с целью улучшения спортивного результата.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Вещество Р

Вещество P (Substance P) - один из наиболее известных пептидов, открытый в 1931 году [42].

Вещество Р - биологически активный пептид из 11 аминокислотных остатков. Вещество Р обладает широким спектром биологической активности: оказывает сосудорасширяющее действие, способствует дегрануляции тучных клеток, является хемоаттрактантом для лейкоцитов, активирует синтез и высвобождение медиаторов воспаления. Показано, что снижение концентрации вещества Р в синовиальной жидкости уменьшает тяжесть экспериментального артрита.

Обладает широким спектром физиологической активности: изменяет артериальное давление крови, капиллярную проницаемость, сокращение гладкой мускулатуры, обладает секретогенным действием, высвобождает пролактин и пищеварительные гормоны. В последнее время интенсивно изучается роль вещества Р и его аналогов в регуляции центральных процессов - порога болевого воздействия, обучения, сна, устойчивости к стрессу. В головном мозге вещество Р участвует в процессах, связанных с функцией другого нейрорегулятора - допамина. При повреждении допаминэргических волокон выявлено снижение экспресии мРНК, кодирующих образование вещества Р, энкефалинов, динорфина. На базе основной структуры вещества Р получено большое число химических производных, которые обладают свойствами сионистов или антагонистов тахикининовых рецепторов [57].

Вещество Р присутствует во многих специфических нейронных путях в головном мозгу, а также в первичных сенсорных волокнах периферических нервов. Некоторые из этих сенсорных нейронов, тела которых лежат в сенсорных ганглиях по обе стороны спинного мозга, содержат вещество Р и выделяют его из своих аксонных окончаний в синапсах со спинальными нейронами. Поскольку вещество Р возбуждает те спинальные нейроны, которые легче всего реагируют на болевые стимулы, было высказано предположение, что оно служит сенсорным медиатором, специфически связанным с передачей информации о боли от периферических болевых рецепторов в центральную нервную систему.

Морфиноподобный пептид энкефалин тоже в изобилии содержится в мелких нейронах в той части спинного мозга, куда приходят волокна, содержащие вещество Р. Энкефалин и препараты опия способны подавлять выделение вещества Р из сенсорных волокон. Поэтому нейроны, содержащие энкефалин, могут регулировать поступление болевых сигналов в головной мозг, модулируя выделение вещества Р на уровне первого переключения в центральной нервной системе. Подобные же тормозные взаимодействия возможны и на более высоких уровнях мозга. Вещество Р - не единственный предполагаемый медиатор, локализующийся, как показано, в сенсорных нейронах; к таким же идентифицированным к настоящему времени веществам относятся ангиотензин, холецистокинин, соматостатин и глутаминовая кислота. Таким образом, по мере того как все больше становится известно о сенсорных медиаторах и их модуляционных механизмах в спинном мозгу, начинает возникать картина поразительной химической сложности.

Гипотетический воротный механизм в первом синаптическом переключении, возможно, регулирует передачу информации о боли от периферических болевых рецепторов к головному мозгу. В задних рогах спинного мозга вставочные нейроны, содержащие пептидный медиатор энкефалин, образуют синапсы на аксонных окончаниях болевых нейронов, которые в качестве медиатора используют вещество Р. Выделяемый вставочными нейронами энкефалин тормозит выход этого вещества, из-за чего воспринимающий нейрон в спинном мозгу получает меньше возбуждающей стимуляции и поэтому посылает в головной мозг меньше связанных с болью импульсов. Такие опийные препараты, как морфий, по-видимому, связываются с незанятыми рецепторами энкефалина, имитируя подавление боли, производимое энкефалиновой системой.[62]

По многим функциональным признакам вещество Р следует отнести к группе тахикининов: сходный спектр физиологических функций, общая система рецепторов, родственные признаки структуры предшественников. Однако тщательное исследование функционального профиля вещества Р и успехи в множественном синтезе его аналогов позволяют условно определить его как отдельную группу [59,44,68].

В группу тахикининов (Tachykinins) входят пептиды, имеющие, как и вещество P, сходную С-концевую последовательность [-(Phe)-Gly-Leu-Met]. Сюда относятся соединения, обозначенные как нейрокинины, нейромедины, бомбезины, а также оригинальные тахикинины, обнаруживаемые у амфибий, рыб и беспозвоночных животных. Другое сходство относится к наличию общего предшественника - бета-препротахикинина.

Распределение тахикининов в тканях одного и того же организма (в первую очередь, высших позвоночных) весьма разнообразно. Поэтому столь же широк спектр их физиологической активности: сокращение гладкой мускулатуры кишечника, бронхов, зрачка глаза, медиация центральных (поведенческих) и гормональных процессов, высвобождение других физиологически активных веществ, периферическая ноцицепция.

Функциональное разнообразие тахикининов связано с их взаимодействием с другими физиологически активными веществами, как пептидной (бета-эндорфин, нейропептид Y, ген-кальцитониновый пептид), так и непептидной природы - допамином, интерлейкинами и др. Существенным в рассмотрении этой группы пептидов оказалось выявление сложной системы тахикининовых - нейрокининовых рецепторов (NK1, NK2, NK3) и их подтипов.

Современная фармакология тахикининов и вещества Р в значительной мере сосредоточена на исследовании тканевой и видовой специфичности этих рецепторов, а также поиске разнообразных антагонистов, нивелирующих эффекты тахикининов.[63,69].

1.2 Ферменты обмена регуляторных пептидов

Нейропептиды - это полифункциональные высокоактивные вещества пептидной природы, которые играют важную роль в реализации и регуляции различных фи-зиологических и поведенческих реакций организма.

Нейропептиды играют важную роль в адаптационных процессах, проявляют анальгетические эффекты, участвуют в формировании пищедобывательного и полового поведения [20,22,24,28]. Многие из этих веществ вовлекаются в регуляцию полового созревания [2,5,29,33]. Нейропептиды влия-ют на половую дифференциацию организма (гонадотропин-рилизинг-фактор, ЛГ, ФСГ, пролактин [19,21,34], на процессы внимания и памяти (например, АКТГ и б-меланотро-пин - стимуляторы запоминания и внимания), на эмоциональ-ное поведение (тиролиберин, меланостатин, кортиколиберин - стимуляторы эмоционального поведения), обладают анальгезирующим действием (нейротензин, опиоидные пептиды).

Уровень нейропептидов определяется соотношением скоростей их синтеза и деградации.

Нейропептиды синтезируются в организме на рибосомах гранулярного эндоплазматического ретикулума в виде высокомолекулярных неактивных предшественников (препропептидов) [11,17]. В состав последних могут входить аминокислотная последовательность как одного, так и нескольких нейропептидов. Известно много белков, содержащих в своей структуре последовательности нейропептидов: предшественник гонадотропин-рилизинг-фактора, проопиомеланокортин, препроэнкефалин А, продинорфин (препроэнкефалин В) и другие [26,1].

Все препропептиды содержат на N-конце сигнальную последовательность из 15-20 остатков гидрофобных аминокислот. Нейропептиды, входящие в состав предшественника, как правило, ограничены с C- и N-концов парами остатков основных аминокислот - аргинина и лизина.

Сигнальная последовательность препропептидов необходима для взаимодействия с рецепторами эндоплазматического ретикулума и переноса предшественника нейропепти-да в просвет ретикулума. В цистернах эндоплазматического ретикулума под действием сигнальной эндопептидазы происходит отщепление сигнальной последовательности, а также N-гликозилирование и формирование характерной для полипептида третичной структуры, которая препятствует обратному выходу белка в цитоплазму. Посттрансляционная модификация, включающая гликозилирование, амидирование, ацетилирование или сульфирование, предотвращает нарушение процессинга и образование нетипичных пептидов.

Для получения активных форм, полипептиды подвергаются посттрансляционному процессингу, одним из основных механизмов которого является ограниченный протеолиз [3,6,14].

Процессинг биологически активных пептидов [6,7] осуществляется при передвижении молекул пропептидов по гранулярному эндоплазматическому ретикулуму, комп-лексу Гольджи и в секреторных везикулах [55]. Секреторные везикулы содержат полный набор ферментов, необходимых для процессинга и специальные системы поддержания pH внутри везикул [15].

Процессинг нейропептидов [64] внутри секреторных везикул включает в себя эндо- и экзопротеолитические реакции. Эндопротеолиз осуществляется при действии трипсиноподобных протеиназ (проопиомеланокортин-превращающего фермента [65,66], продинорфин-превращающего фермента [47], тиоловой прогормонконвертазы [39,40], субтилизиновых эндопептидаз семейства фурина, PC1, PC2, PC3 и PC4 [73]. В результате происходит расщепление пропептидов по парам остатков основных аминокислот [15,77].

Продукт, образовавшийся после действия эндопептидаз, далее подвергается экзопротеолизу с участием аминопептидазо-В- и/или карбоксипептидазо-В-подобных ферментов [7,9]. В результате происходит удаление ”лишних” N- и/или С-концевых остатков основных аминокислот.

Известно, что в различных тканях из одного белкового предшественника образуются различные нейропептиды. Так из проопиомеланокортина в аденогипофизе образуются преимущественно АКТГ, в-липотропин и в-эндорфин. В промежуточной доле гипофиза они подвергаются дальнейшему расщеплению с образованием б-меланоцитстимулирующего гормона и фрагментов в-эндорфина [3]. Тканевая специфичность, по-видимому, может быть связана с различным набором ферментов в разных тканях и/или с различными способами регуляции их активности. Поэтому представляет интерес изучение ферментов процессинга со сходной (но не идентичной) субстратной специфичностью. Такие исследования интересны не только для выяснения вопросов, связанных с функционированием данных ферментов, но и для понимания механизмов образования различных нейропептидов из одних и тех же предшественников в разных тканях.

Поскольку карбоксипептидазо-В-подобные ферменты, то есть отщепляющие остатки основных аминокислот (аргинина и лизина) с карбоксильного конца пептидов, участвуют в конечной стадии процессинга биологически активных пептидов, то их изучение представляет особый интерес. Также эти ферменты участвуют в инактивации нейропептидов. В сыворотке крови такими ферментами являются карбоксипептидаза N (КПN) и ангиотензин-превращающий фермент (АПФ).

1.2.1 Карбоксипептидаза N

Карбоксипептидаза N (КПN, энкефалинконвертаза, карбоксипептидаза Е, КФ 3.4.17.10) выделена и охарактеризована из мозга, гипофиза, хромаффинных гранул надпочечников, эндокринных клеток поджелудочной железы. Во всех органах и тканях КПN представлена двумя формами: растворимой и мембраносвязанной. Обе формы являются гликопротеинами, имеют идентичную субстратную специфичность и чувствительность к групп-специфичным реагентам. Молекулярная масса мембранной формы 55-57 кДа, растворимой формы - 53-57 кДа [45,52,53].

Карбоксипептидаза N является тиолзависимым металлоферментом, в активном центре которого находится Zn2+.[54] Фермент имеет оптимум рН 5,5-6,0, активируется ионами Co2+ в 5-10 раз, ионами Ni2+ в 2-3 раза, ингибируется CuCl2, HgCl2, аминопропилмеркаптоянтарной кислотой, 2-меркаптометил-3-гуанидилэтилтиопропановой кислотой, ЭДТА и 1,10-фенантролином. Сульфат цинка, хлорид кальция, N-этилмалеимид и ФМСФ не влияют на активность КПN [78]. Наиболее эффективными ингибиторами являются ГЭМЯК и гуанидинопропилянтарная кислота с Ki 8,8 нМ и 7,5 нМ, соответственно. КПN ингибируется Met- и Leu-энкефалинами, веществом Р, вазопрессином, окситоцином, тиреотропин-рилизинг-фактором [59].

Уровни мРНК КПN и активности КПN в мозге и тканях в целом коррелируют между собой. Наивысшие уровни мРНК КПN обнаружены в пирамидальных клетках гиппокампа, в передней и промежуточной долях гипофиза, эпендимных клетках боковых желудочков мозга, базолатеральной миндалине, супраоптическом и паравентрикулярном ядрах. Средние уровни мРНК КПN у крыс обнаружены в таламусе, медиальном коленчатом ядре, коре мозжечка и промежуточной оливе. Наименьшие уровни выявлены в гранулярном клеточном слое гиппокампа, латеральном гипоталамусе, бледном шаре и в ретикулярной формации ножки мозга.

В клетке КПN локализована, в основном, в секреторных гранулах, причем часто совместно с биологически активными пептидами - инсулином [45], энкефалинами [58], вазопрессином [71], окситоцином [70], веществом P [44], атриальным натрийуретическим фактором.[67].

Она обладает, практически, абсолютной специфичностью по отношению к пептидным субстратам с С-концевыми остатками основных аминокислот. КПN хорошо отщепляет остатки лизина и аргинина от Arg8-вазопрессин-Gly-Lys-Arg [71], а также превращает 125I-Met-энкефалин-Arg6 и 125I-Met-энкефалин-Lys6 в 125I-Met-энкефалин. Фермент отщепляет остатки -Lys15-Lys16-Arg17 с карбоксильного конца фрагмента АКТГ (АКТГ1-14) и остатки аргинина с С-конца гиппурил-L-Arg и Leu-энкефалин-Arg [58]. КПN с очень низким сродством отщепляет остаток гистидина с карбоксильного конца проокситоцина [76].

Следует отметить, что уровень мРНК КПN способен быстро изменяться в ответ на внешние воздействия, вызывающие изменения уровня биологически активных пептидов или уровня их мРНК. Кроме того, в случае синтеза дефектной (неактивной КПN) (мутация в гене, кодирующем КПN) наблюдается нарушение синтеза и секреции многих биологически активных пептидов.

Физико-химические свойства, субстратная специфичность, тканевая, клеточная и субклеточная локализация, особенности изменения активности фермента при различных фармакологических воздействиях на организм и культуры клеток [13], нарушение синтеза нейропептидов у мышей с дефектной КПN свидетельствуют о том, что исследуемый фермент вовлекается в процессинг многих биологически активных пептидов, таких как энкефалины, АКТГ, -эндорфин, вазопрессин, окситоцин, нейротензин, меланоцитстимулирующий горомон, вещество Р и др. [6], а также участвует в (алкоголизм, стресс, болезнь Альцгеймера, в общем, в адаптационных процессах. [31]

1.2.2 Пептидилдипептидаза А

Ангиотензинпревращающий фермент (АПФ, дипептидил-карбоксипептидаза A, кининаза II, карбоксикатепсин, пептидилдипептидаза А, КФ 3.4.15.1) обладает пептидилдипептидазной и слабыми трипептидилкарбоксипептидазной и эндопептидазной активностями [50]. Он выделен и очищен из разных тканей, в том числе из мозга, различных видов животных[46]. Фермент из всех тканей (эндотелиальная форма), за исключением семенников (тестикулярная форма), имеет очень близкие физико-химические и иммунологические свойства, тогда как фермент из семенников отличается от ангиотензинпревращающего фермента из других источников по молекулярной массе и иммунологическим свойствам.

В мозге обнаружена только эндотелиальная форма. Она состоит из одной полипептидной цепи, имеет молекулярную массу 170-180 кДа и содержит около 13% остатков нейтральных сахаров. Эндотелиальная форма состоит из двух гомологичных доменов, каждый из которых имеет активный центр и центр связывания Zn2+ [10].

Отличия в степени гликозилирования приводят к образованию двух иммунологически идентичных форм, одна из которых (эндотелиальная) с молекулярной массой 180 кДа присутствует, исключая семенники, во всех тканях, в том числе и мозге, а вторая (нейрональная) с молекулярной массой 170 кДа - обнаруживается только в мозге, и не присутствует в других тканях.[41]

Имеются единичные сообщения об обнаружении в различных органах и тканях более высокомолекулярных каталитически активных форм АПФ с молекулярной массой 600 кДа, 430 кДа, 330 кДа, 240 кДа, иммунологически полностью идентичных эндотелиальной форме. В настоящее время неясно, являются ли эти формы предшественниками АПФ, или образуются при гель-фильтрации благодаря склонности молекул фермента, как и других мембраносвязанных белков, к агрегации. pI фермента из различных органов и тканей колеблется в пределах от 4,6 до 5,1, что обусловливает дополнительную гетерогенность фермента при электрофоретическом разделении. Полагают, что гетерогенность АПФ может иметь важное значение для избирательности регуляции его активности в различных тканях. [25].

Страницы: 1, 2