Репликация, сохранение и модификация генома

ермент, катализирующий комплементарное копирование РНК с образованием ДНК, называется обратной транскриптазой. Он содержится в ретровирусных частицах и активируется после попадания вируса в клетку и разрушения его липидно-гликопротеиновой оболочки. Вполне вероятно, что обратной транскрипции способствуют какие-то вспомогательные белки, находящиеся внутри вирионов, поскольку в присутствии последних ферментативная реакция протекает гораздо эффективнее и быстрее, чем в присутствии очищенного фермента. Появляется все больше данных о том, что обратная транскрипция происходит в самых разных эукариотических клетках, а обратная транскриптаза играет важную роль в процессах перестройки генома

Обратные транскриптазы ретровирусов по существу являются ДНК-полимеразами, и in vitro могут использовать в качестве матрицы ДНК. Однако гораздо эффективнее они работают, если матрицей является РНК. Как и все ДНК-полимеразы, обратные транскриптазы не способны инициировать синтез новых цепей ДНК. Но если синтез уже инициирован с помощью праймерной РНК или 3'-концево-го участка ДНК, то фермент эффективно осуществляет синтез, используя цепь ДНК как матрицу.

Ретровирусы - это диплоидные организмы, поскольку каждый вирион содержит две идентичные цепи РНК размером от 8000 до 10000 нуклеотидов. Цепи соединены вблизи своих 5'-концов, однако природа этого нековалентного взаимодействия неизвестна. Области 5' - и 3'-концов обеих цепей модифицированы, как и у всех эукариотических мРНК. Рассматривая механизм обратной транскрипции, необходимо отметить наличие пяти структурных элементов у вирусной РНК:

1) прямые повторы на 5' - и 3'-концах РНК;

2) последовательность из 80-120 нуклеотидов, соседствующая с 5'-концевым повтором;

3) последовательность из 170-1200 нуклеотидов, соседствующая с 3'-конце-вым повтором;

4) последовательность из 15-20 нуклеотидов, в пределах которой клеточная тРНК спаривается с ретровирусной РНК, что создает праймер для синтеза первой цепи ДНК;

5) сегмент Ри, находящийся непосредственно перед повтором U3 и являющийся сайтом для праймирования второй цепи ДНК; такой сегмент одинаков у РНК всех ретровирусов определенного типа.

Известны три продукта, образующиеся в результате обратной транскрипции: форма А - линейный дуплекс ДНК с последовательностью U3RU5, имеющийся на обоих концах дуплекса; два кольцевых дуплекса ДНК, производных формы А; форма В с LTR-повторами на обоих концах и форма С только с одним LTR. Объяснить образование структур А, В и С при обратной транскрипции вирусной ДНК весьма непросто. Процесс начинается с наращивания тРНК-праймера на матрицах U5 и R в направлении 3' - >5'. Затем РНКаза Н, специфичная к РНК в составе гибридного РНК-ДНК-дуплекса, расщепляет сегмент РНК этого дуплекса. Поскольку на 3'-конце РНК имеется повтор R, новосинтезированная короткая цепь ДНК "перепрыгивает" на этот конец молекулы мРНК и спаривается там с комплементарным ей участком. Далее происходит удлинение цепи ДНК с использованием в качестве матрицы остальной части мРНК. К моменту завершения синтеза первой цепи ДНК большая часть вирусной ДНК разрушается РНКазой Н. Затем в предполагаемом сайте связывания праймера вблизи повтора U3 инициируется синтез второй цепи ДНК с использованием новосинтезированной первой цепи в качестве матрицы. Праймером для синтеза второй цепи может быть РНК, однако как идет синтез второй цепи - непрерывно или прерывисто - неизвестно. После репликации тРНК-связывающей последовательности на 5'-конце первой цепи ДНК тРНК, по-видимому, удаляется. Затем новосинтезированная вторая цепь ДНК спаривается с тРНК-связывающей последовательностью первой цепи. После удлинения 3'-концов каждой цепи завершается образование дуплекса ДНК. Обратите внимание, что на каждом конце ДНК-дуплекса имеется прямой повтор последовательности U3RU5 - LTR. Кольцевые ДНК, по-видимому, образуются либо путем лигирования концов линейной ДНК, либо путем гомологичной рекомбинации между сегментами LTR. Удивительно, что такая сложная последовательность реакций протекает без явного участия ферментов репликации клетки-хозяина. Репликация двухцепочечной формы ретровирусной ДНК не начинается до тех пор, пока она не встроится в клеточную ДНК. Субстратом для такого интеграционного события является продукт обратной транскрипции - линейная дуплексная ДНК. Механизм рекомбинационного встраивания пока полностью не установлен. В результате интеграции образуется структура. При интеграции на обоих концах интегрированной вирусной ДНК утрачивается по нескольку нуклеотидов в пределах LTR-последовательностей и происходит дупликация 3-10 нуклеотидов клеточной ДНК. После интеграции ретровирусная ДНК реплицируется как часть клеточной ДНК. РНК дочерних вирионов образуется в результате транскрипции интегрированных копий вирусной ДНК. Инициация синтеза РНК происходит в крайних левых точках стыковки U3R, а терминация-в крайних правых точках стыковки RU5.

б. Некоторые ДНК-содержащие вирусы используют для репликации обратную транскрипцию

Геном вируса гепатита В человека представлен кольцевой двухцепочечной ДНК с пробелами. Если вирус находится внутри клетки, то пробелы заполняются вирионной ДНК-полимеразой. Такая почти полноразмерная цепь ДНК играет роль матрицы, на которой синтезируется РНК. Длина этой РНК равна длине генома вируса, и она играет роль мРНК в процессе экспрессии вирусных белков и роль матрицы при обратной транскрипции с образованием дочерней вирусной ДНК. Аналогичный механизм реализуется и при репликации вируса мозаики цветной капусты и других вирусов растений.

3. Репарация ДНК

ДНК - это единственная макромолекула клетки, которая способна устранять повреждения, возникающие в ее структуре. Более того, в ней закодирована информация о механизмах самых разнообразных репарационных процессов. Комплементарное спаривание лежит в основе не только репликации ДНК, но и процесса восстановления исходной структуры ДНК при репарации повреждений, затрагивающих остов молекулы, модификаций того или иного основания или ошибочного спаривания при рекомбинации. Одновременное повреждение обеих цепей в одном месте и двухцепочечные разрывы часто оказываются летальными для ДНК, поскольку такие дефекты репарируются лишь в редких случаях.

Наиболее часто происходит разрыв гликозидных связей между пурином и дезоксирибозой N при повышении температуры. За сутки в клетке человека совершается от 5000 до 10000 актов депуринизации. Если не принимать никаких мер, то это приведет к нарушению репликации и экспрессии генов. Кроме того, остатки цитозина и аденина могут подвергаться спонтанному дезаминированию с образованием соответственно остатков урацила и гипоксантина; частота таких событий составляет примерно 100 на геном в сутки. Если подобные нарушения в ДНК не будут устранены до следующего раунда репликации, то они могут послужить источником мутаций.

Многие изменения в структуре ДНК происходят под действием химических веществ, присутствующих в окружающей среде. К таким веществам относятся алкилирующие агенты, которые модифицируют предпочтительно гуаниновые остатки; соединения, встраивающиеся между соседними парами оснований и приводящие к появлению вставок и делеций во время репликации; бифункциональные агенты, способные образовывать ковалентные сшивки между двумя цепями ДНК и блокировать их расхождение при репликации. Не менее разрушительными могут быть и физические воздействия. Поглощение тиминовым или цитозиновым основанием ультрафиолетового света может приводить к образованию циклобутановых димеров между соседними пиримидинами; под действием ионизирующей радиации, например космических лучей, могут образовываться высоко реакционноспособные свободные радикалы, оказывающие на ДНК самые разнообразные воздействия; при облучении рентгеновскими лучами в медицинских целях в ДНК могут возникать одно - и двухцепочечные разрывы, а также другие повреждения, характерные для воздействия на ДНК свободных радикалов.

Как же ДНК противостоит таким разрушительным воздействиям? Благодаря какому механизму восстанавливается нормальная структура нуклеотидов и их последовательность прежде, чем эффект воздействия закрепится и проявится в виде мутации?

Известны два основных типа репарационных процессов:

1) непосредственное исправление модификаций или неправильных спариваний, не требующее репликации для восстановления исходной структуры;

2) удаление нуклеотидов, окружающих ошибочно спаренные или измененные пары оснований, и ре-синтез этого участка путем репликации.

а. Репарация путем прямого восстановления исходной структуры

Под действием алкилирующих агентов, например N-метил-гТГ-нитрозомочевины или Ч^гЧ-диметилнитрозогуанидина, в ДНК образуются О6-метил - или О6-алкилзамещенные гуаниновые остатки. Такие модифицированные остатки гуанина могут деалкилироваться при участии ферментов, присутствующих в клетках бактерий и млекопитающих. О6-метилгуанин-ДНК-алкилтрансфераза катализирует перенос алкильных групп на сульфгидрильные группы цистеиновых остатков фермента, при этом акцепторный белок инактивируется. Содержание алкилтрансферазы в клетках Е. coli увеличивается в присутствии О6-алкилгуанина, но в клетках млекопитающих аналогичной индуцибельности не наблюдается.

При облучении ДНК ультрафиолетовым светом в ней образуются циклобутановые димеры между соседними пиримидиновыми основаниями. Такие соединения блокируют репликацию ДНК, и для сохранения жизнеспособности клетки их необходимо удалить. Один из способов удаления пиримидиновых димеров состоит в ферментативном превращении их в мономеры при освещении раствора видимым светом в диапазоне длин волн 300-600 нм. Такие фотореактивирующие ферменты имеются у бактерий и низших эукариотических организмов, но в клетках млекопитающих они не обнаружены. Фермент образует стабильный комплекс с пиримидиновым димером и, используя энергию поглощенного им света, разрушает димер без разрыва цепей ДНК.

б. Репарация путем замены модифицированных остатков

Замена модифицированного нуклеотида обычно происходит в четыре этапа. Во-первых, фермент распознает этот нуклеотид и надрезает полинуклеотидную цепь вблизи него либо разрывает гликозидную связь между модифицированным основанием и дезоксирибозой. Во-вторых, экзонуклеаза удаляет модифицированный нуклеотид и/или соседние нуклеотиды, оставляя небольшую брешь. В-третьих, удаленный участок синтезируется заново с 3-ОН-конца с использованием в качестве матрицы противоположной цепи. В-четвертых, концы разрыва, образовавшиеся в результате репарации, соединяются с восстановлением ковалентной целостности репарированной цепи.

Сайты, в которых произошла депуринизация или депиримидинизация, выщепляются ферментами, называемыми АР-эндонуклеазами. В клетках про - и эукари - от имеется много разнообразных АР-эндонуклеаз, часто по нескольку разных типов. Некоторые АР-эндонуклеазы надрезают цепь с 3'-стороны АР-сайта, а другие расщепляют диэфирную связь с 3'-сто-роны; в любом случае образуются 3'-гидроксильный и 5'-фосфорильный концы. Разрыв фосфодиэфирной связи по одну или другую сторону от места нарушения позволяет экзонуклеазе удалить прилегающие остатки по обе стороны сайта расщепления и затем ресинтезировать удаленную последовательность.

В репарации N-алкилированных пуринов и других модифицированных оснований ключевую роль играют специфические N-гликозилазы - ферменты, расщепляющие гликозидную связь между модифицированными основаниями и дезоксирибозой. N-гликозилазы используются и при коррекции нарушений, состоящих в спонтанном дезамини-ровании цитозина или аденина и превращении их соответственно в урацил или гипоксантин. Ферменты урацил-гликозилаза и гипоксантин-гликозилаза выщепляют из ДНК соответственно урацил и гипоксантин, оставляя пробелы в месте выщепления. И вновь с помощью механизма выщепления-ресинтеза восстанавливается исходная последовательность поврежденной цепи.

Урацил-гликозилаза играет очень важную антимутагенную роль и при исправлении ошибок, происходящих при использовании во время репликации dUTP вместо dTTP. Поскольку спаривание dUMP с матрицей происходит почти так же хорошо, как и dTMP, Pol III его не распознает, и если dUMP не подвергается специфическому выщеплению, то при последующем раунде репликации в новую цепь может включиться dGMP. Таким образом, г-гликозилаза защищает клетки от возможных мутагенных последствий включения в цепь ДНК dUMP.

Репарация тиминовых димеров может происходить и в темноте одним из следующих двух способов. В клетках Е. coli синтезируются три полипептида, кодируемые генами uvrA, uvrB и uvrC, которые образуют ферментный комплекс uvrЛВC-эндонуклеазу. Этот фермент разрезает цепь ДНК, содержащую пиримидиновый димер, на расстоянии восьми фосфодиэфирных связей с 5'-стороны и четырех или пяти связей с 3'-стороны пиримидинового димера. Удаление поврежденного участка, по-видимому, катализируется геликазой, кодируемой еще одним геном, uvrD. В результате удаляется тиминовый димер и еще примерно 12 окружающих его нуклеотидов. Образовавшийся пробел заполняется с помощью Pol I, а ДНК-лигаза завершает репарацию, соединяя два соседних основания цепи. Некоторые организмы используют для репарации повреждений, возникающих при образовании пиримидиновых димеров, другой механизм. Репарация осуществляется при участии пиримидиновый димер-г-гликозилазы, которая создает апиримидиновый сайт. Гликозидная связь между одним из тиминов и дезоксирибозой разрезается так, что тиминовый димер остается на 5'-конце разорванной цепи, а 3'-ОН-группа - на дезоксирибозе. Образовавшийся 3'-АР-конец отщепляется с помощью 3'-5'-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы, а затем путем ник-трансляции и лигирования удаляется нуклеотид вместе с прилежащим тиминовым димером, заполняется образовавшийся пробел и сшиваются концы цепи.

в. Значение репарации ДНК

У клеток в процессе эволюции выработался сложный механизм устранения повреждений, возникающих в ДНК под действием самых разнообразных химических и физических факторов, а также вследствие ошибок при репликации или рекомбинации. И это вполне понятно: большая часть повреждений блокирует передачу генетической информации последующему поколению, а остальные, если их не устранить, сохранятся в геномах потомков и приведут к драматическим изменениям в молекулах белков, а том числе и ферментов, необходимых для поддержания жизнедеятельности клетки. При повреждении определенных звеньев системы репарации клетки становятся особенно уязвимыми для некоторых химических и физических агентов. Например, клетки Е. coli, у которых нарушена система внесения разрывов в ДНК при выщеплении тиминовых димеров, очень чувствительны к УФ-свету. Клетки, неспособные осуществить ту или иную N-гликозилазную реакцию, гораздо больше, чем нормальные, подвержены мутагенному или летальному эффекту алкилирующих агентов или ионизирующей радиации. У клеток Е. coli, дефектных по Pol I, существенно снижена выживаемость при облучении низкими дозами УФ-света.

У представителя низших эукариот Saccharomyces cerevisiae имеется по крайней мере пять генов, кодирующих белки, которые участвуют во внесении разрывов в УФ-облученную ДНК. Нарушение только в одном из этих пяти RAD-генов приводит к тому, что клетки утрачивают способность к внесению разрывов в ДНК и, следовательно, к удалению пиримидиновых димеров. У дрожжей существуют также мутанты с нарушенной способностью к удалению сшивок между цепями, хотя элиминация УФ-индуцированных повреждений проходит нормально. Это предполагает, что у дрожжей, как и у человека, для удаления поперечных сшивок, а возможно, и для исправления множества других химических модификаций в ДНК существуют специфические, весьма сложные механизмы репарации.

Люди, страдающие пигментной ксеродермой, очень чувствительны к ультрафиолетовому свету, и у них развиваются разные формы рака кожи даже при очень слабом воздействии солнечного света. Клетки таких людей несут мутацию, сходную с RAD-мутацией дрожжей и проявляющуюся в том, что у них нарушена способность к выщеплению пиримидиновых димеров из УФ-облученной ДНК. Заболевание может быть обусловлено мутацией в одном из по крайней мере девяти генов, что говорит о достаточно сложном механизме репарации ДНК, содержащей тиминовые димеры, у человека. Как правило, заболевание бывает связано с неспособностью к выщеплению тиминовых димеров. Если к облученным клеткам в культуре добавить фермент, обладающий тиминдимергликозилазной и АР-эндонуклеазной активностями, то УФ-повреждения могут быть устранены.

4. Рекомбинация ДНК

Генетическая рекомбинация включает несколько связанных между собой процессов, в результате которых в клетках или организмах, где они происходят, создаются новые комбинации элементов носителей генетической информации. Рекомбинация между близко расположенными гомологичными хромосомами приводит к интенсивной перетасовке отцовских и материнских генов в ходе мейоза и тем самым создает предпосылки для эволюционной проверки новых комбинаций этих генов в потомстве. Как правило, рекомбинационные события, происходящие в соматических клетках либо во время репликации ДНК, либо после нее и проявляющиеся в виде обмена сестринских хроматид, не приводят к изменению генотипа или фенотипа клетки. Однако нередко они порождают различные геномные перестройки. Это, например, утрата, приобретение или амплификация генетических элементов и установление новых взаимосвязей между уже имеющимися, но по-новому расположенными элементами.

Если использовать молекулярные термины, то можно сказать, что генетическая рекомбинация состоит в образовании ковалентных связей между нуклеотидными последовательностями из разных областей одной и той же или разных молекул ДНК.

Все клетки и многие вирусы содержат информацию о синтезе ферментов, предназначенных не только для репарации повреждений в собственной ДНК, но и ферментов, осуществляющих рекомбинацию. На самом деле некоторые ферменты, участвующие в репликации и репарации ДНК, играют ключевую роль и при рекомбинации. В этом разделе мы рассмотрим механизмы некоторых рекомбинационных процессов и ферменты, которые их катализируют. Особое внимание будет обращено на рекомбинацию у бактерий и фагов, поскольку у них эти процессы довольно хорошо изучены. Несмотря на то что генетические и морфологические аспекты рекомбинации в эукариотических клетках известны, на молекулярном уровне здесь многое остается неясным.

а. Типы рекомбинации

Существуют три типа рекомбинации: общая, или гомологичная, сайт-специфическая и случайная, или негомологичная.

Общая рекомбинация. Общая рекомбинация происходит, как правило, между протяженными участками идентичных или гомологичных нуклеотидных последовательностей. Ее часто называют гомологичной рекомбинацией или кроссинговером. При общей рекомбинации происходит разрыв двух гомологичных участков ДНК, и каждый из концов одного сегмента соединяется с соответствующими концами другого таким образом, что обе образующиеся молекулы содержат разные фрагменты обеих участвующих в рекомбинации ДНК. На самом деле сайты, по которым происходят разрыв и воссоединение каждой из двух цепей, очень часто не совпадают.

Обычно общая рекомбинация происходит между гомологичными и аллельными участками разных молекул ДНК, но она может произойти и между гомологичными, но неаллельными областями ре-комбинирующих молекул. В этом случае один из продуктов рекомбинации утрачивает часть ДНК, а другой приобретает "лишний" сегмент. Такой процесс получил название неравного кроссинговера. Иногда рекомбинация происходит между неаллельными участками одной и той же хромосомы с соответствующей потерей области, лежащей между сайтами рекомбинации. В отличие от уже рассмотренных случаев некоторые рекомбинационные события нереципрокны; как следствие, один из образовавшихся продуктов идентичен одной из исходных молекул, а другой отличается от обоих партнеров. Такой процесс часто называется генной конверсией.

Сайт-специфическая рекомбинация. Рекомбинация называется сайт-специфической, если сайты разрыва и воссоединения в двух рекомбинирующих молекулах или двух фрагментах одной и той же молекулы ДНК находятся в пределах довольно коротких специфических гомологичных нуклеотидных последовательностей - как правило, не более 25 нуклеотидов. Такие короткие последовательности может иметь только один из партнеров или оба. В качестве примера первого варианта можно привести транспозиции некоторых мобильных элементов у эу - и прокариот, а второго - процесс интеграции-выщепления ДНК фага X из хромосомы Е. coli. С помощью сайт-специфической рекомбинации происходят запрограммированные перестройки хромосомной ДНК при смене типов спаривания у дрожжей; она ответственна также за разнообразие антител. По-видимому, общая рекомбинация между любыми парами гомологичных последовательностей осуществляется с помощью одного и того же комплекса ферментов; с другой стороны, для каждого случая сайт-специфической рекомбинации необходим свой набор ферментов. Негомологичная рекомбинация. Рекомбинация между негомологичными нуклеотидными последовательностями происходит в клетках прокариот и дрожжей достаточно редко, а в клетках млекопитающих - весьма часто. К негомологичной рекомбинации можно отнести процесс случайного встраивания вирусной или плазмидной ДНК в ДНК клеток животных, в результате чего в реплицирующихся геномах паповавирусов появляется множество делеций и дупликаций. Концы разорванной ДНК могут соединиться, даже если они негомологичны. В некоторых случаях рекомбинация происходит между последовательностями, содержащими несколько гомологичных пар оснований, или между короткими частично гомологичными участками. Но, как правило, рекомбинирующие сегменты не имеют гомологичных последовательностей.

б. Общая рекомбинация между гомологичными молекулами ДНК

Общая рекомбинация при согласованном внесении разрывов и воссоединении цепей двух спиралей ДНК с образованием протяженных гетеродуплексных областей. Чтобы могла произойти рекомбинация между двойными спиралями, каждая из четырех цепей должна быть разорвана и затем соединена с новым партнером. Соответствующие цепи обоих линейных гомологичных дуплексов ДНК надрезаются и свободные концы одной спирали спариваются с комплементарными участками другой. Перекрест стабилизируется сшиванием концов донорных цепей со свободными концами реципиентных спиралей. Точка перекреста обменивающихся цепей перемещается вдоль спиралей - процесс, называемый миграцией ветви. При этом происходит одновременное расхождение цепей исходных спиралей и их реассоциация с новыми партнерами с образованием дочерних дуплексов. Структуры дие, а также ж называются структурами Холлидея по имени исследователя, впервые их предложившего.

Структуры Холлидея могут переходить в рекомбинантные двойные спирали путем внесения разрыва и воссоединения цепей двумя альтернативными способами. Один способ состоит в разрезании и воссоединении перекрещивающихся цепей. Два реципрокных продукта л и м могут образоваться, если разрыв и последующее воссоединение цепей произойдут в точке перекреста в структурах е и д или по линии пересечения четырех цепей в изомерной структуре Холлидея и. Размер обменивающихся фрагментов зависит от расстояния, на которое произошла миграция ветви до акта рекомбинации. Альтернативные продукты н и о образуются в том случае, если структура Холлидея з переходит в результате разрыва в к.

В основе рекомбинации данного типа лежит гомологичное спаривание цепей, принадлежащих двум разным спиралям ДНК, поэтому скорее всего она произойдет в том месте, где такое спаривание возможно a priori и где гомологичность последовательностей достаточно велика, чтобы могла произойти миграция ветви в рамках структуры со скрестившимися цепями. Отсюда можно понять, почему общая, или гомологичная, рекомбинация происходит также между двумя повторами в пределах одной молекулы ДНК или между аллельными и неаллельными элементами одной и той же последовательности в двух разных хромосомах.

В ходе миграции ветви при спаривании цепей, принадлежащих разным спиралям, образуются гетеродуплексы. В таких гетеродуплексах в пределах сегмента между сайтом начала образования структуры Холлидея и сайтом кроссинговера может содержаться по одному или более ошибочно спаренных оснований. Они удаляются так же, как любые модифицированные основания при репарации ДНК. Однако, поскольку удалено может быть любое из ошибочно спаренных оснований, в обеих рекомбинантных спиралях в данном сайте могут оказаться одинаковые пары оснований, т.е. рекомбинация для этого сайта окажется нереципрокной. Таким образом, каждая из рекомбинантных спиралей может быть похожа на любой из начальных дуплексов в тех позициях, где исходно они различались.

Общая рекомбинация с образованием двухцепочечного разрыва. Альтернативный механизм общей рекомбинации включает образование двухцепочечного разрыва в одном из дуплексов-партнеров. Далее с помощью экзонуклеаз в месте разрыва образуется брешь. При спаривании 3'-одноцепочечного конца бреши с комплементарной цепью интактной спирали в последней образуется петля. Размер этой петли увеличивается по мере того, как ДНК-полимераза наращивает 3'-конец "вклинившейся" цепи. В итоге другой одноцепочечный конец бреши спаривается с комплементарной последовательностью в перемещающейся петле. В результате такого спаривания образуется система "праймер-матрица", и ДНК-полимераза синтезирует недостающую цепь, заполняя брешь. Лигирование двух растущих концов с исходными цепями приводит к образованию двойной структуры Холлидея. Миграция ветви в одном или обоих перекрестах передвигает оба места сцепления в любом направлении, при этом в участках, фланкирующих брешь, могут возникать ошибки. Разделение таких структур может идти двумя способами - с перекрестом и без него, с образованием четырех дуплексов.

Необходимо отметить некоторые особенности этого механизма. Образование ошибочных пар в районах, фланкирующих брешь, обусловливает получение как реципрокных, так и нереципрокных рекомбинаций между генетическими маркерами. Если двухцепочечный разрыв происходит вблизи участка, где между спиралями имеются различия, то рекомбинанты унаследуют нуклеотидную последовательность партнера, у которого разрыва не происходило. Этот механизм объясняет многие случаи генной конверсии, особенно те, в которых протяженная последовательность одного дуплекса замещается соответствующей, но отличающейся последовательностью другого дуплекса.

Нереципрокная общая рекомбинация используется и при репарации некоторых повреждений ДНК. Например, если тиминовые димеры не были удалены из УФ-облученной ДНК до того, как к ним подошла репликативная вилка, то синтез комплементарной цепи в этом участке не может быть завершен. Поскольку тиминовые димеры, находящиеся напротив бреши, не могут быть выщеплены, остается один путь для спасения хроматиды - использовать генетическую информацию гомологичной сестринской хроматиды и заполнить брешь. Для этого применяется такой же механизм, как для репарации брешей.

в. Ферменты, участвующие в общей рекомбинации

В общей рекомбинации участвуют два специфических фермента и еще несколько ферментов, катализирующих также процессы репликации и репарации ДНК. Энзимология общей рекомбинации изучена только для некоторых прокариотических организмов, в частности E. coli и ее фагов. Один из специфических ферментов, необходимых для успешной гомологичной рекомбинации, называется recA-белком. Он катализирует обмен одиночными цепями, используя энергию гидролиза АТР до ADP и неорганического фосфата. RecA-зависимое внедрение одноцепочечных ДНК в дуплекс - первый этап рекомбинационного процесса в рамках обеих схем Холлидея и механизма с образованием двухцепочечных разрывов. Второй фермент, состоящий из трех отдельных субъединиц и поэтому называемый recBCD-нуклеазой, обладает эндо - и экзонуклеазной, а также геликазной активностями. Механизм его действия до конца не установлен, однако известно, что recBCD-нуклеаза индуцирует разрывы в дуплексной ДНК и благодаря присущей ей геликазной активности вместе с recA инициирует рекомбинационный процесс. Идентифицирован также фермент, разрезающий узлы в структурах Холлидея; при его участии образуются липкие концы, соединяемые лигазой.

В общей рекомбинации участвуют также геликазы и белки, связывающиеся с одноцепочечной ДНК; оба они необходимы для обеспечения процесса миграции ветви. Как известно, перемещению цепей во время миграции ветви способствует Pol I, а в воссоединении разорванных цепей участвует ДНК-лигаза. Для снятия топологических ограничений при раскручивании спирали и для распутывания перекрученных структур, по-видимому, нужны топоизомераза типа I и, возможно, гираза.

г. Сайт-специфическая рекомбинация

Сайт-специфическая рекомбинация происходит между специфическими сегментами дуплексов ДНК, не имеющими протяженных гомологичных участков. Характерным примером такой рекомбинации служит интеграция кольцевой ДНК фага X с хромосомой Е. coli и ее обратное выщепление. Несмотря на то что эти рекомбинационные события также включают разрыв и воссоединение двух спиральных сегментов ДНК, их механизм абсолютно отличен от механизма общей рекомбинации. В этом случае рекомбинация происходит в пределах специфической нуклеотидной последовательности ДНК фага X и уникальной последовательности ДНК Е. coli. Нуклеотидные последовательности attP - и attВ-сайтов совершенно различны, хотя имеют общее ядро протяженностью в 15 нуклеотидных пар. AttP простирается на 150 нуклеотидов влево и на 75 нуклеотидов вправо от общего ядра, a attB - это сегмент длиной всего около 25 нуклеотидов, включая и ядро. Рекомбинационные события, происходящие как при интеграции, так и при исключении ДНК фага X из хромосомы Е. coli.

Поскольку нуклеотидные последовательности, фланкирующие attP - и а?? В-сайты слева и справа, для этих сайтов различаются, механизм рекомбинационного выщепления ДНК фага X из ДНК Е. coli должен отличаться от механизма их рекомбинационной интеграции. И действительно, для рекомбинации между attL и attR при исключении фаговой ДНК помимо белка Int необходимы фаговый белок xis и клеточный белок HF. Процесс рекомбинационного выщепления, по-видимому, имеет некоторое сходство с процессом интеграции, но роль указанных трех белков, особенно белка xis, все еще изучается.

5. Репликация

Образование РНК-содержащих вирусов происходит путем репликации их РНК, тогда как все клеточные РНК образуются в результате транскрипции ДНК. Здесь мы рассмотрим лишь процесс репликации вирусной РНК как таковой, не касаясь связи репликации с жизненным циклом соответствующих вирусов.

За исключением ретровирусов, репликация РНК в основном повторяет процесс репликации ДНК. Цепи РНК также удлиняются на один нуклеотид за один акт в направлении 5'->3' путем присоединения рибонуклеотидтрифосфата к 3'-ОН-концу растущей цепи. Как и при репликации ДНК, порядок расположения нуклеотидов определяется комплементарным копированием матрицы, в данном случае обязательно цепи РНК. Ферменты, осуществляющие этот процесс, называются РНК-зависимыми репликазами.

РНК бактериальных вирусов R17 и MS2, а также полиовирусов и вируса Синдбис, инфицирующих животных, всегда обозначается знаком, поскольку последовательность их РНК-геномов идентична последовательности мРНК. Таким образом, геном инфицирующего вируса может служить в качестве мРНК и содержит информацию о синтезе некоторых, если не всех, вирусных белков. Специфическая репликаза, кодируемая геномом вируса и образующаяся вскоре после инфекции, связывается с одним или несколькими белками клетки-хозяина и инициирует процесс копирования - цепи с ее 3'-конца с образованием полной - цепи, ассоциированной с - цепью-матрицей. Затем та же репликаза, возможно вместе с другими вирусными белками, синтезирует множество копий - цепи РНК, используя новосинтезированную цепь в качестве матрицы. С единственной - матричной цепи РНК синтезируется одновременно несколько новых - цепей. У многих вирусов копирование - или - цепей инициируется путем спаривания рибонуклеозидтрифосфата с первым нуклеотидом на 3'-конце матричной цепи.

Цепь РНК полиовируса реплицируется способом, аналогичным представленному, но его геномная РНК имеет одну особенность - к ее 5'-концу с помощью фосфодиэфирной связи присоединен белок через тирозиновый остаток. У - цепи, синтезируемой в первом раунде репликации, этот белок отсутствует. Однако все цепи, образующиеся на цепи как на матрице, содержат 5'-концевой белок, даже когда их длина еще очень мала. Это позволяет предположить, что репликаза полиовирусов использует гидроксильную группу тирозина в качестве праймера при инициации новых - цепей, в то время как - цепи фермент может инициировать de novo.

Геном некоторых вирусов представлен одной цепью РНК, нуклеотидная последовательность которой комплементарна, а не идентична последовательности мРНК. Такие геномы обозначают знаком. Существуют также вирусы, геном которых состоит из множественных - цепей РНК, при этом каждый такой сегмент соответствует одному или двум вирусным генам. Если геном вируса представлен одной или более - цепями РНК, то в самом вирионе содержится комплекс геномной РНК со специфической репликазой. После проникновения в клетку комплекс активируется, и на - цепях как на матрицах синтезируются - цепи. Новосинтезированные - цепи играют роль мРНК для синтеза новых или дополнительных репликационных белков и роль матрицы при синтезе дочерних - цепей.

Геном некоторых вирусов представлен двухцепочечной РНК, содержащей и - , и - цепи. Репликация у таких вирусов также инициируется ферментами, содержащимися в самом вирионе. Эти ферменты копируют - цепь дуплекса РНК консервативным путем - цепи отделяются). Белки-репликазы, транслируемые с этих - цепей мРНК, синтезируют затем комплементарные - цепи, которые, объединяясь с - цепями, образуют дочерние двухцепочечные РНК вируса.

Имеющиеся данные о структуре и функции РНК-репликаз весьма ограниченны. Наиболее детально изучена РНК-репликаза, синтезируемая РНК-содержащим колифагом Qp. Она состоит из четырех идентичных полипептидов, причем только один из них кодируется вирусным геномом. Этот полипептид не способен реплицировать - цепи вируса, он может катализировать только ограниченную реакцию присоединения рибонуклеотидов. Остальные три белка, входящие в состав РНК-репликазы фага QP, являются компонентами хозяйского аппарата синтеза белка, и их точная функция в процессе репликации РНК неизвестна. Инициация и репликация, осуществляемые РНК-репликазой, кодируемой вирусами животных, также зависит от активности белков, образуемых клеткой-хозяином. Отличительная особенность РНК-репликаз состоит в их необычной способности специфически узнавать нуклеотидные последовательности на 3'-концах как и цепей, что гарантирует инициацию синтеза новых цепей.

Страницы: 1, 2, 3