Продукты рекомбинации: характеристика и манипулирование

спользуют также гибридные соматические клетки, содержащие лишь часть определенной хромосомы донора. Например, некоторые линии донорных клеток содержат хромосому с делецией или хромосому, несущую небольшой транслоцированный участок из другой хромосомы, и за прошедшие годы были выделены и охарактеризованы многие линии гибридных клеток, содержащие делетированные или составные донорные хромосомы. Например, с помощью таких гибридных клеток гены тяжелой цепи иммуноглобулина человека были локализованы в положении 32 длинного плеча хромосомы 14. Были проанализированы две линии гибридных клеток мыши и человека, каждая из которых содержала одну из пары реципрокных транслокаций между хромосомой 14 и Х-хромосомой. Зонд, представляющий собой клонированный ген иммуноглобулина, гибридизовался только с ДНК из гибрида, содержащего часть хромосомы 14, соответствующую q32.

В результате анализа клонов из библиотек, содержащих ДНК одной хромосомы, были получены детальные карты участков индивидуальных хромосом. Наиболее прямой путь получения таких библиотек состоит в использовании отдельных очищенных хромосом. Другой подход основан на использовании ДНК из гибридных соматических клеток, содержащих только одну донорную хромосому. Из такой библиотеки могут быть отобраны рекомбинанты, содержащие последовательности донорной ДНК, по их способности гибридизоваться с видоспецифичными зондами.

в. Нестабильность при клонировании

Как правило, клонированные вставки представляют собой точные реплики геномных последовательностей, однако иногда во время клонирования в этих последовательностях происходят изменения. Несоответствие размеров клонированной вставки и сегмента геномной ДНК чаще всего бывает обусловлено рекомбинациями, делециями или вставками, произошедшими во время клонирования. Нередко наблюдаются вариации в размерах вставки или в ее рестрикционной карте при повторном выделении. Если клонированный фрагмент содержит тандемные повторы, то при расщеплении рекомбинантной ДНК часто получается сложная смесь рестрикционных фрагментов. Например, некоторые фрагменты могут быть представлены в количестве меньшем, чем моль-эквивалент. Это тоже свидетельствует о происшедших во время репликации рекомбинантной молекулы перестройках, что приводит к образованию смешанной популяции рекомбинантов. Перестройка состоит в гомологичной рекомбинации, сопровождающейся делециями и амплификациями клонированных тандемно повторяющихся единиц. Подобная нестабильность клонированных повторов в Е. сой-системах хозяин-вектор уменьшается, но не устраняется полностью в клетках, мутантных по функциям рекомбинации.

Определение числа копий данной последовательности в геноме

Ген овальбумина присутствует в гаплоидном геноме курицы в единственном экземпляре, однако многие гены и некоторые другие сегменты ДНК встречаются в геноме множество раз. Типичными примерами геномов с многократно повторяющимися последовательностями ДНК являются эукариотические геномы. Иногда несколько копий в таком геноме бывают абсолютно идентичны, и тогда при отжиге смеси рестрикционных фрагментов геномной ДНК с меченым гомологичным зондом на электрофореграмме наблюдается одна полоса, четко видимая даже в том случае, когда количество расщепляемой ДНК не превышает 1 мкг. Обычно для обнаружения сегмента, представленного в геноме млекопитающих лишь однократно, требуется не менее 10 мкг ДНК, поэтому появление полосы при количестве ДНК 1 мкг и менее свидетельствует о том, что данный сегмент представлен в геноме многократно. Если разные копии последовательности различаются по одной или нескольким парам оснований, то у них могут быть и неодинаковые сайты для рестриктирующих эндонуклеаз. В результате на радиоавтограмме будет присутствовать множество полос или она будет представлять собой одно размытое темное пятно; это зависит от числа копий повторяющейся последовательности.

а. Оценка числа копий с помощью гибридизации ДНК-ДНК

Число копий можно оценить, проведя денситометрический анализ радиоавтограммы. При этом для повышения точности в отдельные лунки на этой же пластине геля вносят известное количество немеченой клонированной ДНК как образец геномной ДНК. Плотность радиоавтографа линейно зависит от количества ДНК в геле, поскольку зонд присутствует в избытке. Сравнивая между собой эти показатели для геномной ДНК и ДНК стандарта, мы можем оценить число копий.

б. Оценка числа копий по кинетике реассоциации ДНК

Более точную информацию о числе копий можно получить, исследуя кинетику реассоциации ДНК. Кинетические методы стали применяться в этой области по крайней мере на десять лет раньше методов, описанных в разд.7.5. а, и именно с их помощью были получены первые данные о том, что эукариотические геномы содержат много повторов. Для того чтобы понять суть кинетического метода, необходимо вывести несколько уравнений.

Скорость реассоциации отдельных комплементарных цепей в растворе зависит от концентрации ДНК и подчиняется кинетике второго порядка. Если

С0 и С-это суммарные концентрации денатурированной ДНК в момент времени t0 и в момент времени t после начала гибридизации соответственно, то скорость реакции описывается уравнением

Хотя, чем больше размер генома, тем меньше истинная концентрация каждого гибридизующегося фрагмента. Другими словами, в более сложном геноме каждый гибридизующийся фрагмент составляет меньшую часть суммарной ДНК и поэтому гибридизуется при более высоких значениях Cot. Таким образом, кинетические кривые позволяют оценить размер генома, если у нас имеется препарат геномной ДНК известного размера, который может служить стандартом, и если кривые соответствуют кинетике второго порядка. Если Na и Nb-размеры геномов а и b, то

где С - число молей мононуклеотидов на 1 л, t - время в секундах.

Величина обычно обозначается словом, которое пишется и произносится как "Cot".

Как и во многих экспериментах по гибридизации, ДНК перед денатурацией и реассоциацией была разрезана на фрагменты длиной около 400 пар оснований. Обратите внимание на то, что шкала Cot логарифмическая; это облегчает сравнительный анализ данных. Соответствие кинетических кривых простой реакции второго порядка следует из того, что ренатурация на 90% укладывается в интервал значений Cot, охватывающий два порядка величины.

Конкретные значения Cot0.5 зависят от общего размера генома, поскольку С - это суммарная кон-

Характер кинетических кривых второго порядка для ДНК SV40, Т4 и E. coli позволяет сделать вывод о том, что каждый геномный сегмент представлен в геноме только один раз. Аналогичные кривые для эукариотической геномной ДНК имеют более сложную форму. В качестве примера приведены данные для ДНК Drosophila. Гибридизация протекает в широком диапазоне значений Cot, поскольку многие сегменты ДНК повторяются, причем одни из них многократно, другие менее часто, а третьи - лишь несколько раз. Те сегменты, которые встречаются в геноме только один раз, имеют низкую концентрацию и гибридизуются при самых высоких значениях Cot. Большинство высокоповторяющихся последовательностей, концентрация которых наиболее высока, гибридизуются очень быстро и характеризуются самыми низкими значениями Cot. Предположив, что гибридизация сегментов ДНК, представленных в единственном числе, следует кинетике второго порядка, можно из сложных Cot-кривых с помощью метода наименьших квадратов выделить отдельную кривую для однокопийной последовательности и оценить ее Cot.

Для таких последовательностей Drosophila значение Cot05 равно 28,6 моль"с/л при экспериментальных условиях, которые использовались в случае. Это значение принято за стандартное; сравнивая с ним значение Cot0.5 для какого-то клонированного фрагмента ДНК Drosophila, можно рассчитать число копий этого фрагмента по формуле.

Вторая кривая относится к гибридизации клонированного фрагмента в присутствии суммарной геномной ДНК Drosophila. Клонированный фрагмент помечен радиоизотопом, благодаря чему кинетику его гибридизации можно регистрировать отдельно. Заметим, что концентрация фрагмента достаточно мала, так что его самогибридизацией можно пренебречь. Эффективная концентрация клонированной последовательности обеспечивается соответствующими последовательностями геномной ДНК. Поэтому значение C0t по оси абсцисс, используемое для получения значения Cot для фрагмента, рассчитывается из концентрации геномной ДНК Drosophila, а С и С0 по оси ординат относятся к фракции клонированной ДНК, которая гибридизовалась. Вот почему значения C0t действительно относятся к геномной ДНК. Значение Cot0.5 для клонированной последовательности равно 1,06, а число копий составляет 28,6/1,06 = 27.

Для определения числа копий от одной до десяти этот метод малопригоден, поскольку для достижения высоких значений Cot требуется длительное время или очень высокие концентрации ДНК. Эта проблема еще более усложняется, если геном имеет большой размер, поскольку увеличивается значение Cot0 5 для однокопийных сегментов. Значение Cot0 5 для таких последовательностей в геноме Drosophila, имеющем размер 1,7*108 пар нуклеотидов, равно 28,6, а соответствующее значение Cot0.5 для генома млекопитающих по меньшей мере в десять раз выше.

На самом деле кинетический анализ гибридизации несколько более сложен, чем это здесь представлено. Скорость гибридизации зависит не только от концентрации ДНК, но и от температуры, ионной силы, вязкости раствора и размера гибридизующихся фрагментов. Все эти параметры должны быть строго фиксированными.

Процент гибридизовавшейся ДНК измеряют разными способами. Во-первых, можно использовать тот факт, что при определенных условиях с гидроксилапатитом связывается дуплексная, но не одноцепочечная ДНК. Во-вторых, можно определять в разные моменты времени процент ДНК, которая становится устойчивой к нуклеазе, специфичной в отношении одноцепочечной ДНК. Результаты, получаемые с помощью этих двух методов, различаются, если анализируются сложные эукариотические геномы. Нуклеазный метод позволяет определять только количество дуплексной ДНК, образовавшейся при реассоциации, а метод осаждения на гидроксилапатите дает не только количество дуплексной ДНК, но и ДНК с неспаренными одноцепочечными хвостами. Такие дуплексы образуются, в частности, в результате случайных разрывов одиночных цепей еще до реассоциации с образованием фрагментов подходящих размеров, а также благодаря наличию повторяющихся последовательностей. Нуклеаза S1 расщепляет все одиночные нереассоциировавшие цепи, а также все одноцепочечные концы дуплексов. Гидроксилапатит связывает все дуплексные цепи, включая и цепи с одноцепочечными хвостами, и поэтому дает более высокую оценку доли гибридизовавшихся цепей, чем нуклеазный метод. Иными словами, в опытах с применением гидроксилапатита мы получаем большую степень реассоциации ДНК и большую скорость реассоциации, чем в опытах с 81-нуклеазой. Эти различия уменьшаются, если используются относительно короткие фрагменты ДНК.

в. Оценка числа копий с помощью гибридизации в условиях насыщения

Еще один метод оценки числа копий состоит в определении общего количества ДНК клонированного сегмента, реассоциирующегося с известным количеством геномной ДНК. Клонированный сегмент должен присутствовать в избытке в отличие от ситуации, описанной в разд.7.5. б, где в избытке присутствовала геномная ДНК. Гибридизация в условиях насыщения особенно полезна в тех случаях, когда исследуемый сегмент присутствует в ДНК в очень малом числе копий и изучение реассоциации затруднено.

Эксперимент состоит в следующем. Возрастающее количество препарата радиоактивно меченного клонированного сегмента инкубируют с фиксированным количеством денатурированной и фрагментированной геномной ДНК и определяют количество гибридизовавшейся клонированной ДНК. Время реакции должно быть достаточным для достижения насыщения. Лучше, чтобы меченый фрагмент был одноцепочечным; это позволяет избежать его самогибридизации при относительно высоких концентрациях, необходимых для получения насыщения. В условиях насыщения все клонированные геномные сегменты связаны с зондом. Высота плато дает суммарное число гомологичных последовательностей в геноме, которое можно рассчитать исходя из удельной радиоактивности меченого фрагмента. Для повышения точности метода проводят калибровочные эксперименты, в которых к препаратам геномной ДНК добавляют известные количества немеченого клонированного фрагмента. В эксперименте количество гибридизовавшегося радиоактивного фрагмента при насыщении эквивалентно двум копиям гена на гаплоидный геном. Чтобы упростить эксперимент, препараты денатурированной геномной ДНК фиксируют в виде пятен на нитроцеллюлозном фильтре. В усовершенствованном варианте сначала определяют насыщающую концентрацию радиоактивного зонда, а затем инкубируют зонд с разным количеством геномной ДНК, фиксированной на нитроцеллюлозном фильтре.

Изменение клонированных сегментов: получение мутантов

а. Общие положения

В основе классического генетического анализа лежит получение случайных мутаций, вызывающих наследуемые фенотипические изменения. Разработка новых молекулярно-генетических методов привела к созданию так называемой обратной генетики. В охарактеризованные клонированные гены вносят специфические мутации и затем устанавливают корреляцию между изменениями в определенных участках этих генов и изменением фенотипа или локализуют регуляторные элементы. Например, если в кодирующую часть гена внести мутации, то на нем будет синтезироваться модифицированный полипептид. Это позволяет изучать влияние аминокислотной последовательности белка на его кон-формацию или ферментативную активность. Аналогично нуклеотидная замена в предполагаемом регуляторном участке может привести к подавлению или стимуляции транскрипции, что подтвердит предположение о функциональной роли данного участка.

Существуют разные способы внесения мутаций в клонированные фрагменты или небольшие геномы, но мы рассмотрим лишь немногие из них. Во всех случаях успех зависит от двух условий. Во-первых, должна быть хорошо известна структура исходной ДНК. Как минимум, необходимо знать подробную карту сайтов рестрикции, но еще лучше, если известна вся последовательность изучаемого фрагмента. Во-вторых, поскольку все методы дают некую смесь продуктов, нужный элемент следует очистить с помощью клонирования, амплифицировать и охарактеризовать. При некоторых типах мутагенеза мутации образуются в случайных местах, при других - в определенных сайтах; о последних говорят как о сайт-специфических мутациях.

б. Делеционные мутанты

Использование рестриктирующих эндонуклеаз. Внести делецию в определенный участок можно в том случае, если клонированный фрагмент ДНК содержит два близко расположенных уникальных сайта рестрикции в интересующей нас области. После эндонуклеазного расщепления фрагмента образующиеся "хвосты" отщепляют с помощью специфичной к одноцепочечным участкам нуклеазы и тупые концы вновь сшивают. Однако столь простой подход применим лишь в редких случаях. Чаще используют другой метод, при котором делецию создают в окрестности одного уникального сайта рестрикции. После эндонуклеазного разрезания фрагмента соседние нуклеотиды удаляют с помощью эндонуклеазы Bal 31 или какой-либо экзонуклеазы, например ехоШ E. coli, совместно с нуклеазой S1. При последующем лигировании образуется семейство молекул с делециями, расположенными вокруг исходного эндонуклеазного сайта. Делеционные мутанты очищают с помощью молекулярного клонирования. В одном из вариантов этого метода перед образованием кольцевой молекулы к концам присоединяют рестриктазные линкеры. При этом в молекулу вводятся эндонуклеазные сайты, которые могут оказаться полезными для исследования ее свойств, секвенирования и последующего моделирования.

При помощи более сложных манипуляций может быть получен целый набор делеций разной длины, берущих начало от одного исходного сайта. Для этого рекомбинантную молекулу обрабатывают двумя способами. Из одной ее части удаляют с помощью двух рестриктирующих эндонуклеаз большой сегмент, включающий мишень для делеций. Вторую часть линеаризуют с помощью одного из двух ферментов и затем обрабатывают ферментом Bal 31. Далее в результате разрезания вторым ферментом получают набор фрагментов уменьшающейся длины. Лигирование этих фрагментов с частью А и последующее клонирование дает набор молекул с делециями, начинающимися в сайте RE1.

Использование неспецифических эндонуклеаз. В сверхспиральные кольцевые молекулы могут быть внесены единичные разрывы с помощью неспецифических эндонуклеаз, например ДНКазы I. При этом образуется целый набор линейных молекул с разрывами в разных сайтах. После внесения разрыва и расширения делетированной области осуществляют лигирование с помощью методов, описанных ранее для устранения эндонуклеазных разрывов. При таком подходе используют некоторые интересные свойства ДНКазы I: в присутствии Мп2+ этот фермент расщепляет сразу обе цепи дуплексной ДНК, а в присутствии Mg2+ гидролизует за один раз только одну цепь, в результате чего в ДНК появляются одноцепочечные пробелы. Кроме того, фермент расщепляет сверхспиральную ДНК быстрее, чем линейную дуплексную, вследствие локальной неупорядоченности ДНК в сверхспиральном состоянии. Поэтому после непродолжительной обработки сверхспиральной ДНК ДНКазой I в присутствии Mg2+ образуются в основном полноразмерные линейные дуплексные молекулы. Обработка их с помощью Bal 31 или экзонуклеазы, а затем 81-нуклеазы расширяет образовавшийся ранее пробел. После лигирования отдельные продукты можно получить с помощью молекулярного клонирования.

в. Инсерционные мутанты

Принципы конструирования инсерционных мутантов сходны с описанными выше для делеционных мутантов. Клонированный сегмент ДНК расщепляют по одному из сайтов с помощью рестриктирующей эндонуклеазы или неспецифической эндонуклеазы. При необходимости заполняют пробелы на концах образовавшейся линейной молекулы или отщепляют одноцепочечные "хвосты" с помощью нуклеазы и осуществляют лигирование в присутствии сегмента, который хотят встроить в молекулу. В качестве вставки может использоваться синтетический фрагмент, содержащий множество сайтов для рестрикционных эндонуклеаз, - так называемый полилинкер. Если первое расщепление было неспецифичным, то появление новых сайтов рестрикции в наборе клонированных мутантов поможет построить физическую карту мутаций.

г. Точечные мутации

Химический мутагенез. Для получения точечных мутаций в определенном участке молекулы чаще всего используют дуплексную кольцевую ДНК, содержащую короткий одноцепочечный участок. Один из способов создания таких сайт-специфических пробелов состоит в обработке сверхспиральной ДНК соответствующей рестриктирующей эндонуклеазой в присутствии бромистого этидия, который встраивается между плоскостями пар оснований и вносит нарушения в структуру дуплекса. При этих условиях многие рестриктирующие эндонуклеазы разрезают только одну из цепей в соответствующих сайтах. По-видимому, при встраивании бромистого этидия в обычную дуплексную молекулу ДНК разрезания вообще не происходит, а в сверхспиральной молекуле разрезается только одна цепь. Не все рестриктирующие эндонуклеазы ведут себя подобным образом, но все же число их достаточно велико. После разрезания молекулы с помощью экзонуклеазы в дуплексной молекуле создают небольшой одноцепочечный пробел в месте разреза. Альтернативный способ получения дуплексной молекулы с пробелом состоит в использовании векторной системы на основе фага М13. Для этого создают одноцепочечный М13-рекомбинант, содержащий нужный сегмент, а также другой, двухцепочечный, рекомбинант, содержащий такой же сегмент, но с делецией. Этот двухцепочечный рекомбинант денатурируют и реассоциируют с одноцепочечным, в результате чего образуется гетеродуплекс с пробелом.

Если ДНК, содержащую одноцепочечный пробел, обработать бисульфитом натрия, то в одноцепочечном участке произойдет дезаминирование остатков цитозина с образованием урацила, т.е. дезаминируются только определенные остатки цитозина. Если пробел невелик, а число дезаминированных остатков цитозина ограничено благодаря малому времени реакции и низкой концентрации бисульфита, то возникает очень небольшое число специфических мутаций. Далее пробел заполняют с помощью ДНК-полимеразы и осуществляют лигирование. Вместо исходных С"С-пар в молекуле ДНК теперь содержатся пары и"А, которые после репликации превращаются в Т"А-пары.

Мутагенное копирование. Специфические мутации другого типа можно получить, если при заполнении пробела вместо нормального дезоксирибонуклеозидтрифосфата использовать его мутагенный аналог. ДНК-полимераза I способна использовать в качестве субстратов различные аналоги обычных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Некоторые из них являются мутагенами. Например,] М6-гидро-ксидезоксицитидин-5'-трифосфат может включаться в синтезируемую цепь в положение, соответствующее А или G в матричной цепи в зависимости от того, находится ли он в иминной или аминной форме соответственно. Если пробел в дуплексной ДНК заполняется с помощью HO-dCTP вместо dTTP, то напротив А будет находиться HO-dC. После трансфекции и репликации наряду с нормальными формами будут обнаруживаться мутантные геномы с транзициями Т * А - " С * G. Проведя отбор, эти мутанты можно клонировать. Аналогично замещение dCTP на HO-dCTP приводит к транзициям С * G - > Т * А.

Сайт-специфический мутагенез с применением синтетических олигодезоксинуклеотидов. Олигодезоксинуклеотиды можно синтезировать в больших количествах, что позволяет разработать достаточно универсальные методы получения сайт-специфических точечных мутаций в клонированных сегментах ДНК. В основе одного из таких методов лежит образование гетеродуплекса между одноцепочечным синтетическим олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность, и комплементарной одноцепочечной рекомбинантной векторной ДНК, несущей соответствующий сегмент дикого типа. Для этого ген, в котором мы хотим получить мутацию, клонируют, например, в фаге М13 и получают одноцепочечную кольцевую рекомбинантную вирусную ДНК. Затем с этой кольцевой молекулой отжигают синтетический олигодезоксирибонуклеотид длиной от 8 до 20 нуклеотидов, содержащий мутантную последовательность. Этот олигодезоксирибонуклеотид выполняет роль праймера, а оставшийся одноцепочечным участок-роль матрицы при синтезе ДНК in vitro с помощью ДНК-полимеразы I. После копирования всей кольцевой молекулы начало и конец новой цепи соединяют лигазой. Образовавшаяся дуплексная молекула содержит неспаренные основания в мутантной последовательности. Интересно, что фаговое потомство, вышедшее из одной инфицированной клетки, сегрегирует как смешанная популяция фагов дикого типа и мутантных рекомбинантов, которые можно разделить при последующем клонировании.

Страницы: 1, 2, 3, 4