Поры, каналы и переносчики

p align="left">Потенциалзависимый натриевый канал обеспечивает быстрое увеличение натриевой проводимости, ответственное за фазу деполяризации при развитии потенциала действия в нервных и мышечных клетках. Этот канал был очищен до гомогенного состояния из нескольких источников, в частности из мозга крысы, скелетных мышц млекопитающих, сердца цыпленка и электрического органа ската Electrophorus electricus.

Очищенные каналы из Elektrophorus electricus и сердца цыпленка содержат единственную гликопротеиновую субъединицу с мол. массой -260000, в то время как каналы, выделенные из тканей млекопитающих, содержат еще одну или две меньшие субъединицы с мол. массой от ЗЗООО до 38 000. Большую часть из этих очищенных препаратов каналов удалось встроить в плоские мембраны, при этом они сохраняли присущие им in vivo электрофизиологические и фармакологические характеристики. Для успешной реконструкции канала, выделенного из тканей млекопитающих, необходим по меньшей мере один из небольших ассоциированных белков.

Натриевые каналы взаимодействуют с различными токсинами, в частности с тетродотоксином, сакситоксином и а-токсином скорпиона, которые очень прочно связываются с канальными белками и могут использоваться при количественных биохимических измерениях. Присутствие этих токсинов очень важно как для биохимической очистки каналов, так и для изучения их работы in vivo. Как и канал концевой пластинки, натриевые каналы распределены в плазматической мембране не равномерно, а собраны в кластеры. В мышечных клетках Na +-каналы сконцентрированы в районе концевой пластинки вместе с nAChR-каналами.

Нума с соавторами клонировали гены, кодирующие белки натриевых каналов из Electrophorus и главную субъединицу канала из мозга крысы, и определили их нуклеотидную последовательность. Было показано, что белок натриевого канала из Electrophorus содержит 1820 аминокислотных остатков, организованных в четыре повторяющиеся гомологичные единицы. По мнению разных авторов, каждый гомологичный участок содержит 4, 6 или 8 трансмембранных а-спиралей. Некоторые из этих предполагаемых трансмембранных спиралей амфифильны и аналогичны постулированным для nAChR-канала. Имеются экспериментальные данные о том, что карбоксильный конец полипептидной цепи локализован на цитоплазматической поверхности; сообщалось также, что амфифильная 54-спираль является внецитоплаз-матической. Однако никакой дополнительной информации, позволяющей подтвердить предложенные топологические модели, не существует. Нет также данных о том, какие участки полипептида непосредственно вовлечены в образование поры. Различные модели натриевого канала концептуально близки к моделям канала концевой пластинки в том отношении, что канал per se состоит из кластера а-спиралей, образующих центральную пору. В этом случае, однако, вместо пяти различных субъединиц мы имеем четыре гомологичных домена единственной субъединицы. По всей вероятности, специфичные группы организованы в канале таким образом, что образуется «селективный фильтр».

Предельные размеры канала можно оценить, используя метод «молекулярного сита», однако при этом нельзя объяснить селективность канала по отношению к достаточно малым ионам. На рис. 8.10 приведен профиль свободной энергии для диффузии ионов Na+ через канал. Если лимитирующей стадией является дегидратация, то параметром, определяющим высоту энергетического барьера, будет геометрия тех компонентов, которые временно заменяют воду. Для К+ положение соот-

ветствующих групп не будет оптимальным, поскольку этот ион несколько больше по диаметру, а потому энергетический барьер будет выше. Напротив, для К+-селективных каналов соответствующий энергетический барьер будет минимален именно для ионов К +.

В последнее время было построено также много моделей, описывающих регуляцию работы канала при помощи трансмембранного потенциала. В регуляции, без сомнения, участвует изменение заряда белка в ответ на наложение электрического поля. Однако никаких данных о том, какие именно участки полипептида образуют ворота или отвечают на изменение напряжения, не существует. Высказывается предположение, что это может быть амфи-фильная 54-спираль.

Данные об аминокислотной последовательности натриевого канала свидетельствуют о том, что он относится к группе потенциал-зависимых каналов. В эту же группу входят калиевый канал из Drosophila и дигидропиридиновый калиевый канал из скелетных мышц кролика. Все эти белки содержат амфи-фильный положительно заряженный сегмент, аналогичный S4-cer-менту натриевого канала. Это еще раз подтверждает вывод о том, что данный сегмент участвует в регуляции работы канала, отвечая на изменение напряжения на мембране. Отметим, что как натриевый канал из тканей млекопитающих, так и кальциевый канал следующий раздел) имеют субъединицы, функции которых неизвестны.

КАЛЬЦИЕВЫЙ КАНАЛ

Са2 +-селективные каналы очень широко распространены в возбудимых клетках -- нервных и мышечных, а также в большинстве других типов клеток. Некоторые Са2 +-каналы отвечают на изменение напряжения на мембране, а работа других регулируется опосредованно с помощью рецепторов. Обычно концентрация ионов Са2+ в цитоплазме не превышает 10"7 М, что в 10000 раз ниже, чем концентрация ионов Са2+ вне клетки. Из-за этих условий и в отличие от Na + - и К + -каналов открывание Са2 + -канала может приводить к значительным изменениям концентрации этого иона в цитоплазме, что в свою очередь индуцирует разнообразные биохимические события. Например, потенциалзависимое увеличение концентрации ионов Са2+ в цитоплазме приводит к высвобождению нейромедиаторов.

Исходя их фармакологических данных, была проведена классификация Са2+-каналов. Для очистки и дальнейшей харктеристики каналов очень полезными оказались органические блокирующие агенты с высоким сродством к каналам. Единственный класс Са2 + -каналов, охарактеризованных биохимически, -- это потенциалзави-симые каналы, которые блокируются различными органическими соединениями, в частности производными дигидропиридииа. Эти каналы были выделены из сердечной и скелетной мышц и оказались одинаковыми. Они состоят как минимум из двух субъединиц с мол. массой 140000 и 30000. Большая субъединица была клонирована и секвенирована и оказалась структурно близка к потенциалзависимому натриевому каналу.

Появляется все больше данных, свидетельствующих о сходстве структуры различных каналов и пор. В основе всех этих систем лежит заполненная водой пора, выстланная изнутри полярными группами. Пора может быть образована или а-спиральными, или 0-структурными элементами. Чтобы транспорт осуществлялся с высокой скоростью, в канале не обязательно должны присутствовать места связывания, обладающие высоким сродством к переносимым веществам, поскольку селективность определяется высотой энергетических барьеров, а не глубиной впадин. Селективность каналов можно в большинстве случаев объяснить тем, что в нескольких ключевых местах располагаются специфические аминокислотные остатки, определяющие характер тех веществ, которые могут проходить через канал. Возможно, воротные механизмы различных каналов также имеют много общего, но экспериментальные данные по этому поводу пока отсутствуют.

Как мы увидим позже, аналогичные структурные свойства можно обнаружить и у других транспортных белков.

Некоторые унипортеры, симпортеры и антипортеры

К настоящему времени достаточно хорошо охарактеризовано несколько систем, катализирующих транспорт одного или более растворимых веществ. При этом скорость переноса с помощью этих белковых комплексов гораздо ниже, чем даже через наиболее «медленные» каналы. Мы рассмотрим переносчик глюкозы и анионный переносчик из мембраны эритроцита, лактозопермеазу из Е. coli и группу митохондриальных переносчиков. Транспортные функции этих белков весьма разнообразны: оии катализируют облегченную диффузию одного какого-то вещества, симпорт Н + и сахара, в результате чего происходит накопление сахара в клетке, и антипорт растворенного вещества. Отметим некоторые общие свойства этих процессов.

В некоторых случаях эти транспортные белки являются оли-гомерами, обычно димерами. Однако, по-видимому, только у митохондриальных переносчиков канал образуется из структурных элементов разных мономеров. Во всех других случаях, по всей вероятности, каждая субъ-едииица функционирует независимо, даже если она является частью олигомера.

Весьма высокая степень гомологии транспортных белков указывает иа их близкое структурное родство, хотя они существенно различаются как по субстратной специфичности, так и по функциям. Это позволяет предположить, что для широкой группы функционально различных переносчиков характерны общие транспортные механизмы.

В большинстве случаев для анализа работы транспортных белков можно с успехом использовать модели с чередованием кон-формационных состояний, аналогичные модели, схематически представленной на рис. 8.2. При этом лимитирующей стадией является конформационное изменение с той стороной мембраны, где находится место связывания.

В большинстве случаев сродство переносчика к транспортируемому веществу не зависит от того, к какой стороне мембраны обращено место связывания. Однако для первичных активных транспортных систем наблюдается иная картина.

Все рассматриваемые здесь переносчики обычно чувствительны к реагентам, действие которых направлено на сульфгидрильные группы. Однако это не обязательно должно означать, что между переносчиками имеется значительное структурное сходство или они используют одинаковый механизм транспорта. Например, установлено, что ни один из восьми остатков цистеина лактозопермеазы не участвует непосредственно в транспорте. Высказывалось также предположение, что погруженные в мембрану остатки пролина распределены в транспортных белках непропорционально, однако значение этого факта остается неясным.

ПЕРЕНОСЧИК ГЛЮКОЗЫ ИЗ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТА

Этот переносчик охарактеризован наиболее полно из всех белков, катализирующих диффузию единственного вещества через мембрану. Он переносит через эритроцитарную мембрану D-глюкозу, которая затем используется при гликолизе. Такие же или аналогичные переносчики глюкозы присутствуют и в других типах животных клеток. Большой прогресс в этой области исследований был достигнут благодаря секвенированию ДНК, кодирующей переносчик глюкозы из клеток гепатомы человека и из клеток мозга крысы. Очищенный переносчик из эритроцитов представляет собой гликопротеин с кажущейся мол. массой 55 000. По-видимому, в мембране он находится в виде димера. Если судить по данным об аминокислотной последовательности, то переносчик должен содержать 12 трансмембранных а-спиральных участков, однако экспериментальные данные не дают окончательного ответа на этот вопрос. Очищенный переносчик удалось встроить в фосфолипидные везикулы, при этом оказалось, что он ориентирован асимметрично.

Как и при исследовании канальных белков, очень важную роль сыграли опыты с использованием специфических ингибиторов, обладающих высоким сродством к переносчику. В число этих ингибиторов входят цитохалазин В и флоретин, которые связываются с переносчиком со стехиометрией 1:1. Одни ингибиторы связываются с переносчиком только в том случае, если они находятся с цитоплазматической стороны мембраны, другие специфически связываются с наружной стороны мембраны. В работе было показано, что места связывания двух указанных ингибиторов находятся вблизи С-конца полипептида.

Большинство кинетических данных и данных по связыванию согласуются с простой моделью четырех состояний, в которой предполагается, что существует единственное место связывания D-глюкозы, находящееся внутри канала. Для измерения индивидуальных констант скоростей использовали ЯМР и метод остановленной струи. Конформация загруженного канала изменяется с константой скорости 2000 с~', которая приблизительно в семь раз выше аналогичной константы для незагруженного канала. Следовательно, обмен глюкозы происходит с большей скоростью, чем транспорт как таковой, для осуществления которого незагруженный переносчик должен возвратиться через мембрану. Природа конформационного изменения неизвестна, хотя оно было зарегистрировано при помощи инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье и, как предполагают, включает скольжение а-спиралей друг относительно друга.

Между переносчиком глюкозы из клеток млекопитающих и некоторыми транспортными системами бактерий наблюдается значительная гомология. Удивительно, что такая гомология наблюдается также между переносчиком глюкозы и белками, осуществляющими симпорт Н +-арабинозы и Н +-ксилозы. Эти сим-портеры, как и описываемая ниже система транспорта Н +-лактозы, используют для аккумуляции указанных сахаров электрохимический протонный градиент. Переносчик глюкозы из мембраны эритроцитов не транспортирует Н+ и не способен к транспорту против градиента глюкозы. Очень важными представляются работы по изучению взаимосвязи структуры белкового комплекса и механизма его работы.

ЛАКТОЗОПЕРМЕАЗА ИЗ Е. coll

Этот комплекс изучен наиболее полно из всех симпортных белков. Он кодируется /асУ-геном, который является частью lac-оперона, и его часто называют lac-пермеазой. Ген lacY был клонирован и секвенирован, и из штамма-сверхпродуцента был выделен белок -- продукт этого гена. Пермеазу можно изучать в цитоплаз-матических мембранных везикулах, в интактных клетках или в реконструированных протеолипосомах. Судя по дан-

ным об аминокислотной последовательности, белок имеет мол. массу 46 500, хотя результаты электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН дают другую величину. Почти не вызывает сомнения, что функциональной единицей в мембране является мономер, хотя некоторые данные свидетельствуют о существовании димерной формы пермеазы in vivo.

На основании данных об аминокислотной последовательности лактозопермеазы были построена модели, согласно которым этот белок имеет 12 или 14 трансмембранных а-спиралей. Это в основном согласуется со спектроскопическими данными, свидетельствующими о высоком содержании а-спиралей, и немногочисленными топологическими данными. На рис. 8.11 представлена модель, построенная Кабаком, с указанием сегментов, которые, согласно экспериментальным данным, являются цито- или периплаз-матическими.

Пермеаза имеет одно или более мест связывания для протона и одно -- для лактозы. Эти места бывают поочередно обращены к периплазматической и цитоплазматической сторонам мембаны, и соответствующий коиформациониый переход является лимитирующей стадией процесса. Максимальная скорость транспорта равна 25--50 с~1. При наличии трансмембранного протонного электрохимического потенциала для лактозы составляет ~ 80 мкМ; место связывания протона, возможно, характеризуется высоким рКл, поэтому большую часть времени протонировано. При ДДН ¦ = 0 значение Км для лактозы гораздо выше -- 15--20 мМ.

Транспорт лактозы обязательно сопровождается транспортом Н+ со стехиометрией 1:1.

Конечным результатом транспорта является перенос через бислой положительного заряда. Следовательно, важную роль в установлении равновесия и скорости транспорта играют трансмембранный электрический потенциал и разность протонного химического потенциала.

Дополнение 8.4. Генетические подходы и сайт-специфический мутагенез: важные методы изучения лактоэопермеазы

Наиболее ценные данные при изучении лактоэопермеазы были получены с помощью генетических методов. Эти работы начали проводить сравнительно недавно, но уже ясно, что такого рода подходы помогут получить важные результаты при изучении как этой, так и других транспортных систем. С помощью направленного мутагенеза было показано, что при замене аланина-177 или тирозииа-236 данная пермеаза может переносить мальтозу. Эти сайты, отмеченные на рис. 8.11 кружками, могут участвовать в связывании сахара.

Кабак и его коллеги использовали сайт-специфический мутагенез для изучения механизма функционирования пермеазы. Было показано, что замена многих аминокислот не оказывает заметного влияния на кинетику транспорта. Это означает, что данные аминокислоты не принимают прямого участия в транспорте; более того -- их замена не приводит к «глобальным» конформационным изменениям белкового комплекса и не препятствует нормальной организации комплекса в мембране.

Были выделены три мутантные формы, неспособные катализировать определение стадии транспорта. Особенно существенны для нормального транспорта гистидин-322, глутамат-325 и аргинин-302; возможно, эти аминокислоты участвуют в переносе заряда внутри мембраны. Было высказано предположение, что они образуют некую связанную водородными связями группу между спиралями 9 и 10. Пермеаза, в которой глутамат-325 заменен на аланин, не может катализировать активный транспорт или выведение лактозы, но способна осуществлять нормальный обмен лактозы. Следовательно, нагруженная форма переносчика может претерпевать нормальные конформационные изменения, блокируется же какая-то другая стадия полного цикла, возможно депротонирование пермеазы. Можно надеяться, что именно с помощью такого рода экспериментов удастся понять механизм работы данного переносчика. При этом очевидно, что в интерпретации результатов ключевую роль могло бы сыграть установление трехмерной структуры фермента.

Как у Е. coli, так и у высших организмов имеются другие системы симпорта сахара и катионов. Однако лактозопермеаза не гомологична ни переносчикам Н +-ксилозы или Н +-арабинозы, ни переносчику глюкозы млекопитающих. Никакой гомологии не было обнаружено также между лак-тозопермеазой и мелибиозопермеазой из Е. coli. Последняя использует в качестве движущей силы для накопления мелибио-зы симпорт не только Н +, но также и Na +. Способность использовать Na +, по всей вероятности, исключает механизмы с перескакиванием протона по сети водородных связей в пронизывающей мембрану части переносчика. Известен также некий переносчик Na +-глюкозы, который катализирует накопление глюкозы в клетках щеточной каемки кишечника.

БЕЛОК ПОЛОСЫ 3 -- АНИОННЫЙ ПЕРЕНОСЧИК ИЗ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ

На долю белка полосы 3 приходится около 25% общего количества мембранных белков эритроцита человека; сходные белки присутствуют также в неэритроидных клетках. Этот белок выполняет несколько функции, причем их можно соотнести с двумя основными доменами белковой молекулы. N-концевая часть является гидрофильной и локализована с цитоплазмати-ческой стороны эритроцитарной мембраны. Она содержит места связывания для компонентов цитоскелета, а также для ферментов гликолиза и гемоглобина. Этот домен можно удалить путем протеолиза, не затронув С-концевого домена, который остается связанным с мембраной и опосредует С1"/НСОэ~обмен, а также образует канал в мембране, через который может проникать вода. Внецитоплазматический компонент этой части белка содержит также углеводные антигенные детерминанты нескольких систем групп крови. В мембране белок полосы 3 находится в форме димера или тетрамера.

Было проведено клонирование и секвенирование участка кДНК, кодирующего белок полосы 3 из эритроцитов мыши. Эти данные послужили основой для построения модели белка полосы 3. Было высказано предположение, что он имеет 12 трансмембранных а-спиралей, при этом некоторые из них являются ам-фифильными. Экспериментальные данные, подтверждающие эту гипотезу, получены только для нескольких участков полипептида и основаны главным образом на результатах протеолиза и локализации связанных углеводов.

Обширные кинетические исследования согласуются с моделью с чередованием конформации и одним местом связывания. Однако скорость равновесного анионного обмена с помощью переносчика по меньшей мере в 104 раз превышает скорость транспорта как такового. Следовательно, незагруженный переносчик не претерпевает быстрых конформационных превращений, необходимых для того, чтобы анион мог связаться с мембраной. По данным ЯМР с использованием 35С1, у переносчика имеется единственное место связывания, и оно может быть обращено как внутрь, так и наружу. Результаты опытов с использованием игнибиторов транспорта тоже свидетельствуют о том, что в канале имеется единственное место связывания аниона, локализованное где-то в середине канала. При этом предполагается, что переход этого места связывания с одной стороны мембраны на другую блокируется неким «скользящим барьером», который перемещается вдоль канала в результате конформационных изменений. Лимитирующей стадией является конформационный переход нагруженного переносчика, но происходит он достаточно быстро, с частотой 105 с ~1 при 37 °С. По-видимому, такая высокая скорость предотвращает значительные конформационные изменения в белке. Природа этого конформационного перехода и точная структура канала экспериментально не определены.

Конформационный переход загруженного переносчика, лимитирующий весь транспортный процесс, лишь в очень малой степени зависит от мембранного потенциала. Это согласуется с таким кон-формационным переходом, в результате которого через мембрану перемещается 0,1 связанного с белком заряда. Если этот переход сопряжен с перемещением анионного субстрата, то он должен сопровождаться переносом противоиона, например заряженной аминокислотной группы. В отличие от этого потенциалзависимое конформационное изменение, индуцирующее открывание натриевого канала, приводит к результирующему перемещению через мембрану шести связанных с белком зарядов.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5