Определение способности почвенных бактерий к разложению синтетических моющих средств

p align="left">Они распространяются течением и ветром на значительные расстояния, и тем самым стабильные молекулы ПАВ создают угрозу здоровью населения. Присутствие ПАВ повышает также степень опасности других вредных веществ, находящихся в воде и почве при последующих их перемещениях по пищевым цепочкам (www.aquaria.com.ua/coretra.html).

Учитывая уровень производства, распространенность в объектах окружающей среды, широкомасштабное применение в различных отраслях промышленности и быту, можно утверждать, что наиболее значимыми являются анионные ПАВ. При значительном загрязнении почвы тяжелыми металлами, нитратами и присутствии детергентов последние повышают подвижность токсикантов по вертикальному профилю почвы и их переходу с почвы в растениеводческую продукцию. При этом сами детергенты в присутствии в почве других загрязнителей, в частности металлов, также мигрируют в грунтовые воды и транслоцируются в сельхозкультуры в больших количествах, чем в случае присутствия ПАВ в почве в изолированном виде. При значительном поступлении детергентов в почву (свыше 15 мг на кг) создаются наилучшие условия для размножения и длительного выживания микрофлоры, в том числе и патогенной, что может представлять, особенно в летний период, эпидемическую опасность и угрозу здоровью населения. Токсичность детергентов по гигиеническим критериям сравнительно невысока, однако наличие целого ряда специфических свойств (пенообразование, эмульгирование, солюбилизация, влияние на поведение веществ в окружающей среде и др.) у данных загрязнителей позволяет отнести их к разряду вредных веществ, которые способны спровоцировать конфликтную экологическую ситуацию и оказать неблагоприятное влияние на здоровье человека (Голубева, 2006).

В состав многих СМС помимо ПАВ входят разнообразные добавки. К числу наиболее вредных добавок относятся фосфаты.

Они представляют собой большую угрозу для окружающей нас среды. Попадая после стирки вместе со сточными водами в водоемы, фосфаты принимаются действовать как удобрения. «Урожай» водорослей в водоемах начинает расти не по дням, а по часам. Водоросли, разлагаясь, выделяют в огромных количествах метан, аммиак, сероводород, которые уничтожают все живое в воде. Зарастание водоемов и засорение медленнотекущих вод приводят к грубым нарушениям экосистем водоемов, ухудшению кислородного обмена в гидросфере и создают трудности в обеспечении населения питьевой водой. Еще и по этой причине во многих странах законодательно запретили применение фосфатных СМС (Голубева, 2006).

1.6.2 Действие ПАВ на организм человека

Очень многих волнуют вопросы, связанные с вредным влиянием на организм химикатов, входящих в состав широко рекламируемых в печати и по телевидению синтетических моющих средств (СМС), с качеством и безопасностью использования в быту различных видов стиральных порошков. Повсеместное использование СМС привело к формированию нового, постоянно действующего химического фактора среды обитания человека. И это при явном дефиците гигиенических знаний о безопасности употребления СМС.

Основные действующие вещества всех стиральных порошков - это поверхностно активные вещества (ПАВ), которые представляют собой чрезвычайно активные химические соединения. Обладая некоторым химическим родством с определенными компонентами мембран клеток человека и животных, ПАВ, при попадании в организм, скапливаются на клеточных мембранах, покрывая их поверхность тонким слоем, и при определенной концентрации способны вызвать нарушения важнейших биохимических процессов, протекающих в них, нарушить функцию и саму целостность клетки.

Синтетические ПАВ могут оказывать вредное действие на организм человека, т. к. обладают способностью проникать через гисто-гематические, в том числе плацентарные, барьеры, проявлять репродуктивную токсичность, нарушать липидный обмен, ПАВ усиливают проникновение других химических веществ в организм (Алексеева, 1998).

Многие химические соединения, входящие в рецептуру СМС и товаров бытовой химии, обладают кожно-резорбтивным действием, сенсибилизирующим действием, влияют на функции воспроизводства, обладают слабым кумулятивным действием. Отдельные компоненты СМС трансформируются в окружающей среде с образованием опасных для окружающей среды и здоровья людей соединений.

В экспериментах на животных ученые (Голубева, 2006) установили, что ПАВ существенно изменяют интенсивность окислительно-восстановительных реакций, влияют на активность ряда важнейших ферментов, нарушают белковый, углеводный и жировой обмен. Особенно агрессивны в своих действиях анионные ПАВ. Они способны вызвать грубые нарушения иммунитета, развитие аллергии, поражение мозга, печени, почек, легких. Это одна из причин, по которым в странах Западной Европы наложены строгие ограничения на использование АПАВ в составах стиральных порошков. В лучшем случае их содержание не должно превышать 2-7%.

На Западе уже более 10 лет назад отказались от применения в быту порошков, содержащих фосфатные добавки. На рынках Германии, Италии, Австрии, Голландии и Норвегии продаются только бесфосфатные моющие средства. В ФРГ применение фосфатных порошков запрещено федеральным законом. В других странах, таких как Франция, Великобритания, Испания, в соответствии с правительственными решениями, содержание фосфатов в СМС строго регламентировано (не более 12%) (www.aquaria.com.ua/coretra.html).

Это объясняется тем, что наличие фосфатных добавок в порошках приводит к значительному усилению токсических свойств АПАВ. С одной стороны, эти добавки создают условия для более интенсивного проникновения АПАВ через неповрежденную кожу, способствуют усиленному обезжириванию кожных покровов, более активному разрушению клеточных мембран, резко снижают барьерную функцию кожи. ПАВ проникают в микрососуды кожи, всасываются в кровь и распространяются по организму. Это приводит к изменению физико-химических свойств самой крови и нарушению иммунитета. У АПАВ есть способность накапливаться в органах. Например, в мозге оседает 1,9% общего количества АПАВ, попавших на незащищенную кожу, в печени - 0,6% и т.д. Они действуют подобно ядам: в легких вызывают гиперемию, эмфизему, в печени повреждают функцию клеток, что приводит к увеличению холестерина и усиливает явления атеросклероза в сосудах сердца и мозга, нарушает передачу нервных импульсов в центральной и периферической нервной системах (www.aquaria.com.ua/coretra.html).

Они не только усиливают проникновение АПАВ через кожу, но и увеличивают накопление этих веществ на волокнах тканей, подвергающихся стирке. Они способствуют такому прочному сцеплению АПАВ с тканью, что даже 10-кратное полоскание в горячей воде не приводит к полному освобождению одежды от АПАВ. Причем чем сложнее и разветвленнее структура волокна, тем большее количество молекул АПАВ могут к нему «прилипнуть». Сильнее всего держат ПАВ шерстяные, полушерстяные и хлопчатобумажные ткани. В среднем, потенциально небезопасные концентрации ПАВ сохраняются на тканях до 4 суток. Таким образом, создается очаг постоянной интоксикации внутри самого организма. Прочно закрепившись на одежде, молекулы АПАВ при соприкосновении с кожей относительно легко переносятся на ее поверхность и быстро всасываются внутрь, начиная свой разрушительный маршрут по организму (www.ecocoop.ru).

Говорят, что капля никотина убивает лошадь. Вот научный факт: 100 г. ПАВ убивают лошадь весом в 300 кг в течение 24 часов (Голубева, 2006).

Проанализировав теоретический материал можно сделать вывод, что поверхностно-активные вещества несут серьезную угрозу загрязнения окружающей среды, так как многие из них имеют сложное химическое строение, что затрудняет разрушение их в природе. Накапливаясь в почве, воде такие вещества могут оказывать неблагоприятное воздействие на живые организмы, в том числе и человека. Важную роль в разрушении таких загрязнений играют микроорганизмы. Поэтому, на мой взгляд, поиск и изучение таких микроорганизмов в настоящее время является важной задачей.

2. Объекты и методы исследований

Объектом исследования являются чистые культуры микроорганизмов, выделенные из почв. В работе использовано 13 культур микроорганизмов, большинство из которых является Г+ спорообразующими аэробными палочками. Чистые культуры хранились в холодильнике в пробирках со скошенным питательном агаром. Перед началом исследований было произведено обновление штаммов, путем подращивания их на МПБ с последующим пересевом на ПА.

2.1 Методы исследований

2.1.1 Исследование физиолого-биохимических свойств

Для исследования физиолого-биохимических свойств микроорганизмов использовались дифференцировочные пластины. Пластина представляет собой панель с 20 конусообразными лунками, на дно которых нанесены соответствующие субстраты с индикаторами, стабилизированные поливиниловым спиртом. Панель закрывается крышкой. Панель и крышка изготовлены из полистирола. Субстрат с индикаторами вносят в лунки в жидком виде, затем высушивают и стерилизуют.

Специфическое действие препарата заключается в возможности дифференцировать бактерии на основе определения ферментативных систем по их действию на соответствующие субстраты.

Биохимические дифференцировочные пластины предназначены для определения ферментативной активности бактерий, выделяемых в ходе микробиологических исследований. Это может помочь при дальнейшей идентификации до рода и возможно вида.

Подготовка исследуемых образцов

Перед проведением исследования выделенные культуры подлежат изучению на чистоту.

Идентификацию культур, непосредственно из нативного материала, производят со скошенного мясо-пептонного агара (МПА). Используют культуры выращенных в течение 18-24 часов при температуре при температуре 37 оС, без предварительного подращивания их на МПБ (мясо-пептонном бульоне).

Если выделенная культура микроорганизма находилась какое-либо время на хранении при комнатной температуре или в холодильнике, производят предварительный посев ее на МПБ на 2-4 часа при температуре 37 оС, затеи осуществляют пересев культуры на скошенный МПА. Посевы инкубируют в течение 18-24 часов при температуре 37 оС.

Культуру с МПА используют для приготовления суспензии в стерильной 1% пептонной воде рH 7,2-7,4 и доводят мутность суспензии до 10 единиц по отраслевому стандартному образцу мутности бактериальных взвесей, стеклянному. При отсутствии отраслевого стандартного образца в 4,0 мл стерильной 1% пептонной воды вносят 2-3 петли исследуемой культуры до образования видимой мутности.

Проведение исследования

1. Вскрывают упаковку пластин.

2. Регистрируют на крышке панели номер засеваемого штамма.

3. Открывают крышку и располагают панель на столе.

4. Добавляют пипеткой по 0,15 мл микробной суспензии в стерильной 1% пептонной воде во все лунки панели, кроме 17,18,19 которые оставляют свободными.

5. Для создания анаэробных условий добавляют 1-2 капли стерильного вазелинового масла в лунки для определения аргининдегидрогеназы и уреазы (№№11,20).

6. Закрывают крышку панели.

7. Выдерживают пластины в течение 18-24 часов при температуре 37 оС.

Учет результатов

Учет результатов производят визуально в соответствии с цветовым указателем, приложенным к пластинам, 18-24 часа инкубации при 37 оС.

После окончания инкубации открывают крышку панели и в лунки для выявления ацетилметилкарбинола (№10) добавляют 1 каплю 6%-го раствора альфа нафтола и затем 1 каплю 40% раствора гидроокиси калия; для определения фосфатазы (№8) - 1 каплю 20% раствора гидроокиси натрия; для выявления нитратредуктазы (№9) добавляют 1 каплю реактива Грисса. Реакции учитывают немедленно в лунках №8,9, выявление ацетилметилкарбинола (№10) осуществляют через 15-20 минут после закапывания реактивов.

2.1.2 Определение способности роста на средах с добавлением поверхностно-активных веществ

Для определения способности роста на средах с добавлением различных ПАВ использовался чашечный метод. Производился глубинный посев по 1 мл бактериальной суспензии. Использовалось 2 среды: питательный агар и среда М9 (рецепты сред см. в приложении). В качестве селективных агентов использовались СМС на основе АПАВ и КПАВ, а также полиакриламид (ПАА) (НПАВ). ПАВ в количестве 1 мл вносились в среды перед стерилизацией (Турковская, 1997).

2.1.3 Определение активности

Определение способности штаммов подвергать деградации ПАВ определяли с помощью модифицированного нами метода лунок Турковской (Турковская, 1997,): в центре застывшей среды ПА/10 в чашках Петри стерильным пробочным сверлом вырезали лунку. Микроорганизмы высевались штрихом по радиусу от лунки к периферии чашки (посев производится секторами). Затем в лунку стерильно вносили исследуемое ПАВ. Контролем служили чашки с посевами без субстратов. Инкубирование проводили в термостате при 34 оС в течении 3 сут.

Результаты оцениваются через 2-3 суток. Отмечается рост от края чашки к центру, к лунке с ПАВ. Степень активности характеризуется количеством баллов по сравнению с контролем.

2.2 Материалы и оборудование

Культуры микроорганизмов, пробирки, колбы, чашки Петри, шпатели, штативы, предметные и покровные стекла, красители, спиртовка.

При любой микробиологической работе: при посевах, пересевах, выделении, сохранении чистых культур используются стерильные среды, стерильная посуда, стерильные инструменты, чтобы предотвратить возможность попадания посторонней микрофлоры. Посевы производятся в стерильных боксах.

Для обработки посуды применяется стерилизация сухим жаром. Она производится нагреванием в течении 2 часов, при температуре 170 0С в электросушильных шкафах.

Вся посуда перед стерилизацией должна быть вымыта, высушена и завернута в бумагу. Для заворачивания посуды используют газетную бумагу (которая не размокает).

Большинство питательных сред стерилизуют насыщенным паром под давлением в автоклавах. Повышение давления в автоклаве повышает температуру пара, образуемого внутри автоклава и, следовательно, температуру стерилизации (Теппер, 2004).

Среды. В работе использованы полноценные питательные среды: МПА, МПБ. В качестве селективной среды использовалась среда М9 (состав см. в приложении). В качестве селективных агентов использовались СМС на основе АПАВ и КПАВ, а также ПАА (НПАВ).

3. Экспериментальная часть

3.1 Культурально-морфологическая характеристика микроорганизмов

В работе использовалось 13 культур микроорганизмов. Культуральные и морфологические признаки исследуемых микроорганизмов представлены в таблице 1.

Таблица 1. Культурально-морфологичесие признаки микроорганизмов

№ штамма	Признаки	Окраска по Граму
	культуральные	морфологические
1	гладкая, светло-фиолетового цвета, полусухая, блеск слабый, полупрозрачная	мелкие, толстые палочки и споры	+
3	полупрозрачная, светло-фиолетового цвета, шершавая, с блеском, слизистая	толстые споровые палочки, прямые и изогнутые, одиночные, по 2, цепочками, с овальными концами	+
4	светло-фиолетового цвета, шершавая, с блеском, слизистая	толстые споровые палочки, одиночные, по 2, цепочками, с овальными концами	+
5	слизистая, гладкая, с блеском, сероватого цвета, выделяет черный пигмент	мелкие, споровые палочки, одиночные и по 2	+
14	молочного цвета, бугорчатая, с блеском, гладкая, слизистая	очень длинные споровые палочки, изогнутые, овальные концы	+
15	полупрозрачная, с блеском, шершавая, светло-фиолетового цвета, слизистая	короткие споровые палочки	+
17	светло-малинового цвета, гладкая, блестящая, полусухая	крупные палочки, неравномерно прокрашенные, фрагментированные палочки, споры	+
19	культура желтоватого цвета, слизистая консистенция, гладкая	мелкие, неспоровые палочки, тонкие, овальные концы	+ (-)
ХХ	серовато-бежевая колония, блестящая, прозрачная, точечный рост, слизистая консистенция, очень слабый	очень длинные палочки, неспоровые, прямые и изогнутые, с чехлами	+
с	кремового цвета, гладкая, слизистая, с блеском	кокки, разные	+
b	кремового цвета, бугорчатая, блестящая, слизистая	мелкие палочки, одиночные, по 2, слабо прокрашенные	+
а1	сероватого цвета, гладкая, слизистая, с блеском	мелкие, короткие палочки	+
а2	полупрозрачная, с блеском, ризоидная поверхность, слизистая	очень мелкие палочки, неярко прокрашенные	+

Из таблицы видно, что большинство из исследуемых микроорганизмов являются Г+ спорообразующими аэробными палочками, за исключением штаммов b, а1, а2 которые являются Г+ неспоровыми аэробными палочками.

Штамм «с» это Г+ кокки. Однако в более молодой культуре он был представлен Г+ палочками. Также можно отметить, что штамм 19 это грамвариабельные неспоровые палочки.

3.2 Физиолого-биохимическая характеристика микроорганизмов

В работе использовано 13 культур микроорганизмов. Были исследованы физиолого-биохимические свойства по 17 тестам. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2. Физиолого-биохимические свойства микроорганизмов

№ штамма	1	3	хх	5	4	14	15	17	19	а1	а2	b	с
тест
утилизация глюкозы	+	+	+	+	-	+	+	-	+	-	-	+	-
утилизация фруктозы	+	+	+	+	-	+	+	+	-	-	+	+	-
утилизация маннозы	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-
утилизация мальтозы	+	+	+	+	-	+	+	+	-	-	-	-	-
утилизация лактозы	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
утилизация трегалозы	+	+	+	+	-	+	+	+	-	-	-	-	-
утилизация маннита	+	+	+	+	-	+	+	+	+	-	-	-	-
наличие фосфатазы	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
наличие нитратредуктазы	+	+	+	+	-	+	+	+	+	-	+	-	-
образование ацетилметилкарбинола	+	+	+	+	-	+	+	+	-	-	-	-	-
наличие аргининдегидролазы	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-
утилизация ксилозы	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	+	-	-
утилизация сахарозы	+	+	+	+	-	+	+	+	-	-	-	-	-
утилизация арабинозы	+	+	-+	-	-	+	+	+	+	-+	+	+	-
утилизация галактозы	+-	-	-+	-	-	+	-	-	+	-+	+	+	-
утилизация салицина	+	+	+	-	-	+	+	+	-	-	-	+	-
наличие уреазы	-+	-	+	-	-	-	+	+	-	-	+	-	+

Примечания: «+» - реакция положительная, «-» - реакция отрицательная, «-+», «+-» - цвет не полностью соответствует стандарту.

Все исследованные штаммы микроорганизмов обладают фосфатазой, аргининдегидролаза обнаружена только у одного штамма (с), утилизируют маннозу все штаммы за исключением штамма с. Утилизирует ксилозу только штамм с. Утилизация лактоза не обнаружена ни у одного из исследованных штаммов.

По итогам проведения микроскопических исследований можно предположить, что большинство из исследованных культур микроорганизмов относится к р. Bacillus.

3.3 Определение активности микроорганизмов-деструкторов ПАВ

Определение способности штаммов подвергать деградации различные ПАВ осуществляли с помощью метода лунок (Турковская, 1997).

В ходе эксперимента установлено, что выделенные штаммы характеризуются большей активностью по отношению к НПАВ (оценка не менее 4). Менее интенсивный рост отмечался в экспериментах с АПАВ и КПАВ (оценки от 2 до 5). Несмотря на это, отмечаются штаммы, имеющие высокую активность (оценка 4,5) в каждом варианте эксперимента (1,4,15, а2, а1) (см. приложение 2).

Таблица 3. Оценка активности штаммов-деструкторов ПАВ методом лунок

№ штамма	НПАВ	АПАВ	КПАВ
	Оценка
1	5	4	5
3	5	4	3
4	5	4	5
5	5	4	3
14	4	5	3
15	5	4	5
17	5	5	3
19	4	-	-
а1	5	4	4
а2	5	4	5
b	5	4	4
с	5	2	3
хх	5	4	3

Примечание: 5 баллов - очень хороший рост; 4 балла - хороший рост; 3 балла - рост средней интенсивности; 2 - слабый рост.

Микроорганизмы, характеризующиеся высокой активностью в присутствии ПАВ всех классов могут иметь большое значение в процессах очистки окружающей среды от загрязнения синтетическими моющими средствами.

3.4 Определение способности роста микроорганизмов на средах с добавлением различных ПАВ

Определение способности роста исследуемых штаммов микроорганизмов на питательном агаре (ПА) с добавлением СМС на основе АПАВ и КПАВ, а также с добавлением ПАА (НПАВ) производилось чашечным методом. Учет результатов производился через 2 суток. Результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4. Результаты роста микроорганизмов на среде с различными ПАВ

№ штамма	Наличие роста, КОЕ/мл
	КПАВ	АПАВ	НПАВ
1	-	+	+
3	-	+	+
4	-	+	+
5	+	+	+
14	-	+	+
15	-	+	+
17	-	+	+
19	-	+	+
хх	-	+	+
а1	+	+	+
а2	+	+	+
b	+	+	+
с	+	+	+

В ходе эксперимента рост микроорганизмов отмечался на средах с добавлением АПАВ и НПАВ. На среде с добавлением КПАВ только 5 штаммов обнаружили рост.

При микроскопии было установлено, что штаммы микроорганизмов выросшие на среде с добавлением АПАВ не образуют спор. А также не пигментированы. Штаммы, выросшие на среде с добавлением НПАВ ничем не отличались от исходных культур. Штамм №5 на среде с добавлением КПАВ так же не образовывал спор, однако пигментация не изменилась (выделяет черный пигмент).

Выводы

1. В ходе работы исследовано 13 культур микроорганизмов. Все культуры способны расти на средах с добавлением НПАВ и АПАВ. В эксперименте с использованием КПАВ обнаружен рост только 5_ти культур (а1, а2, b, с, 5).

2. Наибольшей активностью исследуемые штаммы обладают по отношению к НПАВ.

3. Все исследуемые штаммы обладают фосфатазой, не утилизируют лактозу. Только штамм а2 обладает аргининдегидролазой. Большинство исследованных штаммов являются аэробными Г+ споровыми палочками. Это позволяет отнести их к роду Bacillus.

Литература

1. Абрамзон А.А. Поверхностно-активные вещества. Свойства и применение. - 2 изд. - Л., 1981. - 330 с.

2. Алексеева А.В. Коллоидная химия. - СПб: «Наука», 1998 - 290 с.

3. Аналитический обзор Комитета по природопользованию за 2005 год. / под ред. Голубева Д.В. и др. / - М.: «Сезам», 2006 - 25 с.

4. Вербина Н.М. Деградация микроорганизмами неприродных органических соединений в окружающей среде. - М.: Микробиология, 1978. - т. 7.

5. Глазовская М.А. Способность окружающей среды к самоочищению // Природа, 1979. - №3.

6. Градова Н.Б., Бабусенко Е.С. Лабораторный практикум по общей микробиологии. - М.: ДеЛи принт, 2001. - 232 с.

7. Елинов М.Н. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. - М.: Медицина, 1998. - 190 с.

8. Королев В.А. Очистка грунтов от загрязнений. - М.: МАИК Наука // Интерпериодика, 2001. - 365 с.

9. Никитин Д.П., Новиков Ю.В. Окружающая среда и человек: Учеб. пособие для студентов вузов. - М.: Высш. школа, 1980. - 424 с.

10. Новиков Ю.В. Экология, окружающая среда и человек: Учеб. пособие для вузов, средних школ и колледжей. - М.: Фаир-пресс, 2002. - 560 с.

11. Поликарпов Н. Действие ПАГов на микро- и макроорганизмы. Аналитический обзор. 2005 г.

12. Ротмистров М.Н., Ставская С.С. Микробиология очистки воды. - К.: Наук. думка, 1978 г. - 268 с.

13. Рубан Е.Л. Физиология и биохимия представителей р. Pseudomonas. - М.: Наука, 1986 г. - 352 с.

14. Савицкая М.Н., Холодова Ю.Д. Полиакриламид. - Киев: Техника, 1969. -188 с.

15. Ставская С.С. Биологическое разрушение АПАВ. - К.: Наук. думка, 1981 г. - 116 с.

16. Таубман А.Б., Маркина 3. H. Коллоидные поверхностно-активные вещества. / пер. с англ. / - M. - 1966 г. - 199 с.

17. Теппер Е.З. и др. Практикум по микробиологии / Шильникова В.К., Переверзева Г.И. - М.: Агропромиздат, 2004. - 233 с.

18. Турковская О.В. Биологические и технологические аспекты микробной очистки сточных вод и природных объектов от поверхностно-активных веществ и нефтепродуктов: Авт. дис. д.б.н. - Саратов, 2000. - 360 с.

19. Успехи коллоидной химии / под ред. И.В. Петрянова-Соколова, К.С. Ахмедова. - Ташкент, 1987.

20. Хотько Н.И., Дмитриев А.П. Водный фактор в передаче инфекций. / Материалы странички ПАВ. - М. - 2006 г.

21. Яковлев С.В. и др. Охрана окружающей среды: Учебник / С.В. Яковлев и др. - М.: Изд-во АСВ, 1998. - 180 с.

22. ГОСТ 17.4.4.02-84. Охрана природы. Почва. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического и гельминтологического исследования. - М.:Изд-во стандартов, 1981. - 6 с.

23. www.aquaria.com.ua/coretra.html

24. www.ecocoop.ru

Приложение

Среда М9 (г/л):

Na2HPO3 - 6,0

KH2PO4 - 3,0

NaCl - 0,5

NH4Cl - 1,0

НПАВ - 0,2-1,0

рН - 7,0-7,2

Питательный агар (ПА) (г/л):

Панкреатический гидролизат рыбной муки - 24

Агар-агар - 12-14

NaCl - 4

Дистиллированная вода - 1 л

рН среды 7,3 - 7,5

Способ приготовления

38,0 г порошка размешать в 1 л дистиллированной воды, кипятить 2 мин. До полного расплавления агара, фильтровать через ватно - марлевый фильтр, разлить в стерильные флаконы и стерилизовать при температуре 121 °С в течение 15 мин.

Среду охладить до температуры 45-50 °С, разлить в стерильные чашки Петри слоем 4-6 мм. После застывания среды чашки подсушить при температуре 37-38 °С в течение 40-60 мин (Теппер, 2004).

Страницы: 1, 2, 3