Мукозный иммунитет

ктивированные Тгд вместе с другими клетками природного иммунитета - гранулоцитами. Моноцитами (которые задействуются при помощи цитокинов) первыми вступают в борьбу с патогенами, которые проникают сквозь слизистые оболочки. Спустя некоторое время к защите присоединяются антигенспецифические Тбв с цитотоксической и хелперной функциями и В-лимфоциты, которые развивают гуморальный иммунный ответ - продуцируют антитела IgA (Рис.6). Слизистые оболочки основное место синтеза антител этого класса.

Рис.6. Димер IgA [1]

1-J-цепь, 2-секреторный компонент

Развитию IgA-ответа в слизистых оболочках способствуют условия микроокружения. Секретированные локализованными в Lamina propria плазматическими клетками IgA транспортируется на поверхность слизистых оболочек, где реализует защитные функции.

Секреторные sIgA защищают слизистые оболочки от патогенов, блокируя сайты связывания их с эпителиальными клетками. Таким образом sIgA выполняют роль первой линии специфической защиты на пути проникновения патогенных микроорганизмов и имеют большое значение для обеспечения невосприимчивости организма к инфекциям, которые ассоциированы со слизистыми оболочками. Дефицит антител этого класса - самая распространенная форма иммунодефицита у европеоидов (1: 700 человек) - обуславливает понижение резистентности к инфекционным агентам, в частности гноеобразующих микроорганизмов, особенно в тех случаях, когда он присоединяется к дефициту определенных субклассов IgG. В защите слизистых, вероятно, могут принимать участия и антитела класса М, поскольку соединенная I-цепью пентамерная молекула IgМ также может выноситься на поверхность эпителия.

Локализованные в слизистых оболочках, в том числе и в перовых бляшках, дендритные и Т-хелперные клетки также принимают участие в индуцировании иммунной толерантности к антигенам, которые попадают per os [2,5].

2. Механизмы, регулирующие образование в слизистых оболочках плазматических клеток, которые продуцируют IgA

Преобразование В-лимфоцитов в плазматические клетки, которые выделяют IgA, сложный многоэтапный процесс, зависимый от участия Т-лимфоцитов и других клеток, а также от продуцированных ними цитокинов. Эта регуляция касается прежде всего двух этапов на пути преобразования В-лимфоцитов: процесса переключения классов (switching) IgM > IgA, а также процесса остаточной дифференциации В-лимфоцитов в клетке, продуцирующей антитела.

2.1 Регуляция процесса переключения классов

Процесс переключения классов происходит в перовых бляшках, главным образом в куполах, при участии дендритных клеток и Тh-лимфоцитов. Кажется, что ключевую роль в этом процессе относительно синтеза IgA играет цитокинин TGF-в. Переключение классов Ig может быть одноэтапным (IgМ> IgA), или - реже - двухэтапным (IgМ > IgG, IgG > IgA).

В лимфатических фолликулах перовых бляшек можно выделить две субпопуляции В-лимфоцитов IgA+: малые В-лимфоциты памяти в состоянии покоя со слабой экспрессией рецептора для агглютинина земляных орехов (peanut agglutinin - PNA) и с сильной экспрессией цепи к, а большие лимфобласты в состоянии деления с сильной экспрессией рецептора для PNA и слабой для цепи к. Первые являются непосредственными предшественниками плазматических клеток, которые находят в слизистых оболочках. Роль другого вида клеток изучается. Процесс активации и переключения классов (IgМ > IgA), вероятно, зависит также от вида антигена. Такое свойство имеет LPS.

2.2 Регуляция пролиферации и дифференциации В-лимфоцитов

Образованные в вышеупомянутых процессах лимфоциты В IgA+, "направленные" (commited) на продукцию антител IgA, подлежат регуляторным влияниям, что приводит к их окончательной дифференциации и продуцирования ними IgA. Из многих исследований выходит, что эти процессы зависимы от Тh цитокинов, прежде всего IL-5 и IL-6. отдельные данные наводят на мысль, что на дифференцировку позитивно влияет также IFN-г. Посредственное влияние, которое усиливает выделение IgA, придает также IL-1. лимфоциты IgA+ в перовых бляшках преобладают над другими популяциями В-лимфоцитов - их процент в центрах размножения бляшек Пеера равняется 60-70%.

Регуляция дифференцирования лимфоцитов В IgA+, правдоподобно, является зависимой также от клеток, которые имеют рецепторы для фрагмента Fc IgA (FcaR), особенно Т-лимфоцитов. Часть этих клеток ответственны за суппресию продукции IgA на периферии, например Т-лимфоциты FcaR+СD8, изолированы с селезенки. Подтверждено. Что этот процесс происходит при участии освобожденного этими лимфоцитами так называемого фактора, который связывает IgA (IgA binding factor - IgA-BF). Другие по очереди лимфоциты ТссаR+ (фенотипаТh), изолированные в бляшках Пеера, преимущественно усиливали гуморальный ответ IgA. Принято, что местная концентрация IgA, как и отношение В-лимфоцитов к Т-лимфоцитам, может существенно моделировать освобождение факторов, которые тормозят или стимулируют IgA, что на основе обратной связи регулировало бы иммунный ответ в пределах этих антител. Определенную роль в регуляции образования IgA в слизистых оболочках играют контрсуппресивные лимфоциты [2,5].

3. Иммунный ответ в слизистых оболочках

Элиминация патогенных микроорганизмов, которые поступают в слизистые оболочки, обеспечивается преимущественно развитием гуморального иммунного ответа с продуцированием секреторных IgA. В перовых бляшках и других фолликулярных структурах, куда попадает антиген с поверхности эпителия, происходит праймирование нитивных Т - и В-лимфоцитов, активация, пролиферация и детерминация путей следующего их дифференцирования. Продуцированные клетками микроокружения цитокины направляют дифференциацию CD4 Т-клеток в Тх2 и Тх3 и переключение синтеза иммуноглобулинов В-лимфоцитами с IgМ-изотипа на IgA-изотип. Переключение изотипа антител, вероятно, индуцирует ТФР-в, которое продуцируется Тх3. Так иногда называют субпопуляцию Т-хелперов, которые локализуются в слизистых оболочках, продуцируют кроме ТФР-в также IL-4 b IL-10 и важные для стимуляции образования IgA-антител В-лимфоцитами слизистых.

Праймированные Т - и В-лимфоциты выходят с перовой бляшки, входят через афферентный лимфатический сосуд в региональный мезентериальный лимфоузел, откуда через грудной проток попадают в кровяное русло, а с кровью в селезенку, где задерживаются на несколько суток (на протяжении которых происходит их дифференцирование), после чего они опять возвращаются в слизистую оболочку (Рис.7) [4].

Рис.7. Развитие иммунного ответа в слизистых оболочках:

ПБ - пеерова бляшка; СП - собственная пластинка слизистой оболочки; I - индуктивная, II - продуктивная, III - эффекторная фаза иммунного ответа.

Кроме клеточного и гуморального иммунного ответов, слизистые оболочки способны к анти-HIV-активности благодаря выделяемым веществам, например некоторым белкам слюны, обладающим ингибиторной активностью в отношении ВИЧ (Табл.1) [1].

Таблица 1. Белки слюны, обладающие ингибиторной активностью по отношению к ВИЧ

Компоненты слюны	Тип фактора	Механизм ингибирования ВИЧ
SLP (secretory leukocyte protease inhibitor)	Ингибирование сериновой протеазы	Взаимодействует с хемокиновыми рецепторами клетки и (или) блокирует стадию раздевания вируса
Муцины	Гликопротеины	Способствует агрегации вируса, уменьшая его титр, нарушает взаимодействие gp120 и gp41
Пролинбогатые белки	Пролинбогатые белки	Предотвращается взаимодействие вируса с клеткой
Лактоферин	Fe-связывающие гликопротеины	Связывается с V3-петлей gp120

4. Мукозные вакцины

В слизистых оболочках функционируют механизмы удаления антигенов с поверхностей, ферментативной деградации антигенов, снижение эффективности их проникновения в антигенпоглощающие М-клетки. Эти факторы усложняют доставку антигена при иммунизации через слизистые оболочки. Для защиты иммунизирующих антигенов их упаковывают в биодеградируемые полимерные или липидные частицы, которые вводят чаще всего орально или назально (Рис.8) [1,7].

Рис.8. Экспрессия антител IgA в слизистых тканях после различных вариантов иммунизации.

а-оральная, б-интраназальная, в-ректальная, г-вагинальная иммунизация.

Новейший подход к созданию мукозных вакцин состоит в получении трансгенных растений, продуцирующих протекливные антигенные белки инфекционных агентов, и использовании их в качестве съедобных вакцин. Стенки клеток растений обеспечивают эффективную защиту находящегося в них антигена в ротовой полости и желудке, содержимое которого имеет кислую реакцию. Поэтому "упакованный" таким образом антиген эффективно достигает кишечника, где индуцирует иммунный ответ на уровне слизистых оболочек. Важной особенность съедобных вакцин является их потенциальная дешевизна, биологическая безопасность, простота хранения и применения. Более того в будущем можно будет создать растения, продуцирующие одновременно несколько протективных антигенов различных патогенов. Это будут мультивалентные съедобные вакцины.

Концепцию производства вакцин в трансгенных растениях впервые сформулировали X. Мэйсои с соавторами (1992 г). Они предприняли попытку получения съедобной вакцины против вируса гепатита В на основе грансгенного табака. Были созданы растения, экспрессирующие поверхностный антиген вируса гепатита В. Рекомбинантный HBsAg выделили из трансгенных растений с помощью иммуноаффинной хроматографии и исследовали под электроннмм микроскопом. Оказалось, что рекомбинантный HBsAg способен собираться в вирусоподобные частицы размером около 22 нм и взаимодейсвовать с антителами, выделенными из крови лиц, инфицированных HBV. Вакцинация мышеи инъекционным способом HBsAg антигеном, выделенным из трансгенных растений табака, стимулировала такой же специфичный иммунный ответ, как и коммерческая дрожжевая субъединичная вакцина Это исследование показало возможность создания трансгенных растений для получения рекомбинантных вирусных белков, обладающих нормальной биологической активностью [3].

На следующем этапе был создан траcгенный картофель, продуцирующий HВsAg, и при скармливании мышам клубней такого картофеля наблюдали развитие специфичного иммунного ответа против вируса гепатита В. В 1999 г. были начаты эксперименты на добровольцах, и у людей, поедавших сырые клубни картофеля, также наблюдали специфичный противовирусный иммунный ответ.

Другая группа исследователей в 1999 г. coздала съедобную вакцину против вируса гепатита В на основе люпина и салата. У мышей, которым скармливали люпин, наблюдалось появление антител к вирусу, а у добровольцев, получавших с пищей трансгенный салат, развивался специфический иммунный ответ на вирусный белок.

X. Мэисон с соавторами создали в 1996 г. трансгенные растения картофеля и табака, экспрессирующие белок нуклеокапсида вируса Норфолка, выбывающего у людей острый гастроэнтерит. Было показано, что чужеродный белок в растении формирует вирусоподобные частицы диаметром 38 нм, идентичные частицам, полученным в культуре клеток насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом. При скармливании клубней трансгенного картофеля мышам у них стимулировалось образование специфического IgG, а при внутрижелудочном введении листьев трансгенного табака наблюдалось появление сывороточного IgG и секреторного IgA, специфичных к вирусоподобным частицам.

В 1995 г. были сконструированы трансгенные растения картофеля, синтезирующие олигомерный полипептид LT-B. LT - это термолабилиный токсин Е. coli, который состоит из

шести субъединиц: фермента LT-A и пяти рецепторсвязывающих полипептидов LT-B. Субъедин6ица LT-A проникает в эпителиальные клетки кишечника и вызывает изменения клеточного метаболизма, приводящие к потере воды клетками. LT-B формируют пентамер, который связывается с GM1-ганглиозидами мембраны эпителиоцитов и обеспечивает транспорт LT-А в клетки. Субьединица LT-В может быть отделена от LT-А и при оральном введении вызывает сильный иммунный ответ слизистой оболочки без каких-либо признаков болезни. Трансгенный картофель, продуцирующий LT-B, использовали в экспериментах на мышах. После четырех кормлений у животных начинал вырабатываться анти-LT-B IgG в сыворотке и IgA в слизистой кишечника. В опытах на добровольцах (1998 г) было обнаружено появление в крови клеток, секретирующих специфические антитела. Эти клетки появляются в крови примерно на 7-й лень после иммунизации (поедания трансгенного картофеля) и по прошествии 14 дней мигрируют в ткань слизистой. Присутствие их в крови с 7-го по 10-й день подтверждает важную роль иммунного ответа слизистой оболочки кишечника. Кроме того, у 91% добровольцев наблюдалось четырехкратное повышение концентрации анти-LT IgG, а у 55% - четырехкратное повышение концентрации анти-LT IgA. В более ранних исследованиях такой же эффект наблюдали при оральном введении определенного количества культуры вирулентной энтеротоксичной Е. coli.

Таблица 2. Свойства некоторых съедобных вакцин, созданных на основе трансгенных растений. СРБ-суммарный растворимый белок, СВ-сырой вес.

Источник иммуногена	Экспрессируемый белок или пептид	Растительная система экспрессии	Максимальный уровень экспрессии	Частота иммуногенность и протективная емкость вакцины	Год опубликования
Вакцины для человека
Энтеротоксигенная E. coli	В-субъединица термолабильного токсина (LT-B) То же // -	Табак Картофель Кукуруза	<0,01% СРБ <0,19% СРБ	Формирует мультимеры, экстрагированный из растения белок иммуногенен при оральном введ. Формирует мультимеры, иммуногенен и протективен при оральном введении (поедании сырых клубней) Иммуногенен и протективен при оральном введении (поед. зерен)	1995 1995, 1998 2000
Холерный вибрион	В-субъединица холерного токсина (СТБ)	Картофель	<0,30% СРБ	Формирует мультимеры, иммуногенен и протективен при оральном введении (поедании сырых клубней)	1997, 1998
Вирус гепатита В	Поверхностный белок оболочки (HBsAg) То же // -	Табак Люпин Салат	<0,01% СРБ <0,01% СВ2 <0,01% СВ	Формирует вирусоподобные частицы, после экстракц. из раст. иммуногенен при инъекцион. введении Иммуногене при оралном введении (поед. листьев) Иммуногене при оральном введении (поед. листьев)	1992, 1995 1999
Вирус Норфолк гастроэнтери-та человека	Белок капсида (NVCP) То же	Табак Картофель	<0,23% СРБ <0,37% СРБ	Формирует вирусоподобные частицы, иммуногенен при оральном введ. экстракта листьев Формирует вирусоподобные частицы, иммуноген. при оральном введении	1996 1996, 2000
Цитомегало-вирус человека	Гликопротеин В	Табак	<0,02% СРБ	Иммунохимически соответствует природному белку	1999
Вирус папилломы человека	Основной капсидный белок (L1)	Картофель	<0,01% СВ	Формирует вирусоподобные частицы, иммуногенен при оральном введ. (поед. сырых клубней)	2003
Вирус кори	Гемагглютинин (MV-H)	Салат	Нет данных	Иммуногенен и протективен при оральном введении (поед. листьев)
Вакцина для кроликов
Кроличный вирус геморрагического заболевания	Основной вирионный белок (VP60)	Картофель	<0,30% СРБ	Иммуногенен и протективен при оральном введении экстракта клубней	1999, 2003
Вакцины для сельскохозяйственных животных
Вирус ящура	Вирионный белок (VP1) То же	Арабидопсис Люцерна	Нет данных Нет данных	Иммуногенен при инъекцион. введении Иммуногенен при инъекцион. или оральном введении	1998 1999

В 2001 г. другая группа ученых сконструировала синтетический ген LT-B, оптимизированный для экспрессии в клубнях картофеля. Введение этого гена под контролем тканеспецифичного промотора в геном картофеля привело к продукции функциональных рекомбинантных пентамеров LT-B в клубнях. При подкожной инъекции экстракт этих клубней вызывал у мышей гуморальный иммунный ответ, сравнимый с ответом на бактериальный LT-B. Эффективным оказалось также скармливание клубней или их внутрижелудочное введение: значительное увеличение содержания анти-LT-антител обнаруживали в сыворотке крови и фекалиях

Группа С. Стретфилда (2001 г) достигла высокого уровня экспрессии LT-B в кукурузе. Скармливание зерна, содержащего чужеродный белок, вызывало у мышей иммунный ответ.

Похожую работу выполнили Т. Аракава с соавторами (1998 г), создав трансгенные растения картофеля, экспрессирующие В-субъединицу холерного токсина (СТ-В). У мышей, получавших с пищей клубни или листья, наблюдалось образование специфических антител в сыворотке крови и в слизистой кишечника, а цитотоксический эффект холерного токсина на культуру клеток почки зеленой мартышки Vero нейтрализовался сывороткой крови иммунизированных мышей. Объем жидкости, накапливаемой в тонком кишечнике, у иммунизированных животных по сравнению с мышами, больными холерой, уменьшился на 60%.

Из-за способности связываться с GМ1-ганглиозмдами эпителиальных клеток кишечника CТ-B может быть эффективной молекулой-носителем для различных полипептидов и индуцировать иммунитет слизистой оболочки. СТ-В облегчает доставку антигена в лимфоидную ткань кишечника и его презентацию.

В ряде экспериментов было показано, что оральное введение аутоантигенов предотвращает развитие аутоиммунных заболеваний, таких как диабет I типа, ревматоидный артрит или рассеянный склероз.Т. Аракава с соавторами (1998 г) показали, что экспрессируемый в картофеле химерным полипептид, состоящий из последовательности СТ-В и присоединенной к ее С-концу последовательности человеческого инсулина, сохранял пентамерную структуру и способность связываться с GМ1-ганглиозмдами, а также обладал иммуногенностью как инсулина, так и CТ-B. У мышей, принимавших с пищей трансгенный картофель, наблюдалось образование анти-CТ-B-антител и значительное замедление развития экспериментально индуцированного диабета.

Работы по созданию съедобных вакцин активно продолжаются. Результаты некоторых исследований приведены в таблице 2. Важным направлением развития данных исследований является создание съедобных вакцин на основе растений, которые могут широко использоваться в пишу без термообработки (томаты, бананы, салат и др.). По принятой в настоящее время концепции для увеличении эффективности съедобных вакцин необходимо решить проблему повышения уровня продукции целевых антигенов в трансгенных растениях, так как классическим подход обеспечивает довольно низкую продуктивность. Большие надежды на решение этой проблемы связывают с разрабатываемыми системами экспрессии на основе вирусов растений и генетической трансформации хлоропластов [6,7].

В течение последних лет был сделан значительный прогресс в понимании роли мукозной иммунной системы в патогенезе ВИЧ

Уменьшение численности CD4+ Т-клеток памяти в основном происходит в острой фазе инфекции и особенно сильно в слизистых оболочках. Степень иммунного дефицита после острой фазы, в частности способность контролировать проникновение патогенов через слизистую оболочку, задает темп иммунной активации и таким образом определяет степень прогрессии СПИДа.

Результаты многих исследований дают надежду на то, что в ближайшее время возможны предотвращение или элиминация на стадии проникновения ВИЧ. Эффективная вакцина должна быстро индуцировать сильный ответ при попадании вируса на слизистую оболочку.

Вакцины, разработанные для предотвращения передачи ВИЧ через слизистые оболочки, должны индуцировать множественный иммунный ответ, в том числе антитела, которые способны блокировать проникновение вируса через мукозные барьеры и начальную инфекцию в клетках-мишенях. Иммунологический анализ у ВИЧ-устойчивых людей и результаты вакцинирования приматов подтверждают, что и секреторные, и сывороточные антитела играют важную роль в защите от инфицирования через слизистые, тогда как цититоксические Т-клетки требуются для элиминации вируса и для предотвращения его системного распространения. Таким образом, можно сделать вывод, что дизайн мукозной вакцины - одна из главных стратегий против ВИЧ [1,7].

Выводы

Иммунная система слизистых поверхностей предохраняет эпителий и лежащие под ним ткани и органы от внешних повреждений. Эта первая линия защиты организма от ряда патогенов, проникающих через слизистую оболочку, включает врожденный иммунитет и (или) мукозный иммунитет.

Эффективный мукозный иммунитет может создавать барьер, который способен дополнять системный иммунитет и тем самым увеличивать вероятность защиты. При инфицировании вакцинированных животных наблюдаются низкий уровень высвобождения вируса из клеток или слабая инфекционность вируса и соответственно меньшая эффективность передачи инфекции [7].

На протяжении многих лет иммунитет слизистой оболочки и мукозные вакцины меньше привлекали внимание, чем они заслуживают, учитывая, что большинство инфекций и аллергий служили первичным местом проникновения, взаимодействия. Но в последние годы методологические достижения позволили более интенсивно изучать иммунные реакции слизистых оболочек, привели к росту интереса в попытке лучше понять особенности слизистой оболочки по сравнению с системным иммунитетом. Эти исследования дали толчок для разработки вакцин, предупреждающих инфицирование слизистой оболочки, и для лечения аллергических и аутоиммунных заболеваний.

Методика, которая облегчает наблюдение за слизистой иммунной реакцией у людей, включая младенцев и детей - главной целевой группы вакцинации против инфекционных заболеваний, была разработана в первую очередь для определения секреторных ответов антител. Однако практические исследования для оценки слизистой Т-клеточной реактивности в клинической и биологической сфере по-прежнему ограничены и методы прогнозирования эффективности иммунотерапии у людей недостаточны.

В серим последних исследовании акцентируется внимание на роли быстрого и необратимого уменьшении числа CD4+ССR5+ Т-клеток в слизистых тканях как на ключевом определяющем факторе прогрессии ВИЧ-инфекции. Следовательно, индукция мукозного иммунитета - главная задачи при разработке вакцин против таких патогенов. Правильный набор подходящей системы доставки антигена в организм является необходимым условием значительного мукозного иммунного ответа [1].

Литература

1. Карамов Э.В., Гарманова А.В., Хаитов. Мукозный иммунитет и его особенности // Иммунология. - 2008. - №6. - с.377-384.

2. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология: Пер. с англ. - М., 2000

3. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия: Учеб. - справ. пособие. - 2-е изд., испр. И доп. - Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. - с.471-475.

Вершигора А.Ю. Імунологія: підручник, за заг. ред. Є.У. Пастер. - К.: Вища шк. ., 2005. - с.44-50, 345-348.

5. Якобисяк М. Імунологія/Переклад з польської за ред. проф. .В. В. Чоп'як. - Вінниця: НОВА КНИГА, 2004, - с.328-345.

6. Jan Holmgren & Cecil Czerkinsky. Mucosal immunity and vaccines // Nature Medicine - 2005. - №11. - р.45 - 53.

7. Czerkinsky, Cecil; Anjuere, Fabienne; McGhee, Jerry R. Mucosal immunity and tolerance: relevance to vaccine development // Immunological Reviews.170: 197-222, August 1999.

8. Mowat, A. M. Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens. Nat. Rev. Immunol.3, 331?341 (2003).

Страницы: 1, 2