бесплатно рефераты
 

Клеточная поверхность: рецепторы, рециклирование мембран и передача сигналов

p align="left">3. Специфическая кии аза превращает некоторое количество 1Рз в тетрафосфорилированный продукт 1Р4. Образуются также другие, в том числе циклические, фосфоинозитиды, и некоторые из них тоже имеют физиологическое значение.

4. Одним из ферментов, регулируемых Са2 +, является фосфолипаза С, которая при низкой концентрации Са2+ использует в качестве субстрата преимущественно PIP2, но при более высокой концентрации Са 2 +, по крайней мере in vitro, использует нефосфорилированиый фосфатидилинозитол. Возможно, это облегчает непосредственный быстрый гидролиз основной части фосфатидилинозитола, но так ли это - неясно.

Наиболее важным ферментом, активируемым Са2 +, является протеинкиназа С. Этот фермент локализован преимущественно в цитозоле до момента появления там диацилглице-рола и Са2 +. Затем в зависимости от присутствия фосфатидилсери-на он связывается с плазматической мембраной и активируется. Эффекты, сходные с действием диацилглицерола, оказывают форболовые эфиры, и протеинкиназу С часто рассматривают как рецептор этих соединений. Одним из признаков участия протеинкиназы С и фосфоинозитидной системы в клеточном ответе на присутствие агониста является дублирование эффектов агониста путем добавления форболовых эфиров, которые непосредственно активируют протеинкиназу С.

В активированном состоянии протеинкиназа С является серини треонинспецнфичной протеинкиназой, которая фосфорилирует как специфические мишени, так и саму себя. Природа такой субстратной специфичности и физиологические последствия фосфори-лирования белков точно не известны. Однако с помощью молекулярного клонирования удалось установить, что существует семейство протиеинкиназ С. Возможно, оии обладают разной специфичностью, как и семейство G_белков.

Механизм регуляции работы протеинкиназы С неизвестен; установлено лишь, что ганглиозиды и лизосфннголипиды ин-гибируют этот фермент, а кроме того, выделен его ингибитор белковой природы.

Диацилглицерол может подвергаться дальнейшей деградации под действием диацилглицероллипазы до арахидоновой кислоты, которая окисляется до множества биологически активных метаболитов, называемых эйкозаноидами и включающих простагландины. Хотя арахидоновая кислота сама является вторым посредником, неясно, насколько существен для ее образования фосфатидилинозитолспецифичный, зависимый от фосфолипазы С путь. С другой стороны, арахидоновая кислота может образовываться из множества фосфолипидов при действии фосфолипазы А2. В нескольких типах клеток путь биосинтеза с участием фосфолипазы Аг более важен.

Итак, суммируя сказанное выше, можно утверждать, что при функционировании рассмотренной сложной системы образуются по меньшей мере три известных вторых посредника: диацилглицерол, 1Рз и арахидоновая кислота. Каждый из них выполняет специфические функции, включая увеличение содержания внутриклеточного Са2 + н активацию Са2 + - зависимых протеинкинаэ. Эта система распространена весьма широко, но детали механизма воздействия с ее помощью на специфические клеточные функции пока неясны.

6.4 Фосфорилирование рецепторов и десенсибилизация

Физиологический ответ на действие гормона или нейромедиатора обычно является кратковременным даже при постоянном присутствии агониста. Это явление называется десенсибилизацией и характерно для многих систем ответа как у эукариот, так и у прокариот. Десенсибилизация системы хемотаксиса Е. coli частично обусловлена ковалентной модификацией рецепторов путем метилирования. В животных клетках решающую роль в десенсибилизации играет фосфорилирование рецепторов.

Индуцируемая лигандом десенсибилизация может рассматриваться в двух вариантах. Гомологичная десенсибилизация происходит тогда, когда ослабляется ответ на специфический агонист, но ответ на другие агоиисты, действующие через разные рецепторы, остается без изменения. Гетерологичная десенсибилизация наблюдается в случае, когда применение одного агониста ослабляет ответ клетки на многочисленные агонисты, действующие через различные рецепторы. В обоих случаях происходит фосфорилирование в основном рецепторных белков. В этих реакциях участвуют две киназы - протеинкиназа С и сАМР-зависимая протеинкинаэа, называемая также протеинкиназой А. Кроме того, рецепторы могут модифицироваться под действием рецепторспецифичных киназ; протекают также реакции аутофосфорилирования, катализируемые теми рецепторами, которые представляют собой тирозиновые протеинкиназы.

В основе гетерологичной десенсибилизации лежит классическая регуляция по типу обратной связи. Агонисты, стимулирующие аденилатциклазы, активируют протеинкиназу А, которая в свою очередь фосфорилирует рецептор и вызывает его десенсибилизацию. Например, фосфорилированный /3_адренергический рецептор обладает меньшей способностью активировать Gs_белок. Аналогичным образом агонисты, стимулирующие фосфатидилинозитольную систему, активируют протеинкиназу С, которая фосфорилирует рецептор и ослабляет ответ. В качестве примера можно привести а 1 - адренергический рецептор. Не исключено также, что рецепторы, связанные с фосфатидилинозитольной системой, модулируются протеинкиназой А, стимулированной сАМР. Примером такого рода является мускариновый ацетилхолиновый рецептор.

Гомологичная десенсибилизация была описана для /3_адренергических рецепторов и включает фосфорилирование рецепторов с помощью рецепторспецифичной киназы. Эта киназа фосфорилирует только комплекс рецептор / агонист, в результате чего происходит интерн ал изация фосфорил ированного рецептора путем эндоцитоза. В эндоцитозных везикулах находится фосфатаза, которая отщепляет фосфатную группу и регенерирует активную форму рецептора, возвращающегося к плазматической мембране. Аналогичная киназа была описана для «светового» рецептора родопсина, где субстратом является его обесцвеченная форма.

Одним из сигналов для интериализации рецепторов может быть фосфорилирование по специфичным сайтам. Например, фосфорилирование рецептора ФРЭ протеинкиназой С приводит к его интериализации. Этот процесс блокируется замещением остатка специфичного треонина на остаток аланина с помощью сайт-специфического мутагенеза. Однако ФРЭ-стимулируемая интерна-лизация рецептора не прекращается, что указывает на множественность сигналов интериализации. Как мы уже говорили, форболо-вые эфиры вызывают фосфорилирование н интернализацию транс-ферринового рецептора.

Интернализация не является единственным механизмом, с помощью которого фосфорилирование ослабляет рецепториый ответ. Активность рецептора, локализованного в плазматической мембране, тоже может регулироваться. Например, фосфорилированный рецептор ФРЭ обладает меньшей тирозинкиназной активностью, а также меньшим сродством к агонисту ФРЭ. Фосфорилированный мускариновый ацетилхолиновый рецептор также дезактивируется в плазматической мембране.

Реакции аутофосфорилирования рецепторов, обладающих тирозинкииазиой активностью, как правило, являются стимуляторными.

Это было показано для инсулинового рецептора, при аутофосфорилировании которого увеличивалась его способность фосфорилировать другие белки, а рецепторная активность становилась независимой от инсулина. С помощью мутагенеза было показано участие в регуляции этих эффектов специфических остатков тирозина, локализованных в цитоплазматическом домене /З-субъединицы.

6.5 Некоторые рецепторы, принимающие участие в передаче сигналов в животных клетках

Мы остановимся на некоторых наиболее важных особенностях трех типичных систем передачи сигнала в животных клетках. Эти системы относительно хорошо изучены и иллюстрируют интересные особенности механизма ответа животных клеток на внешние раздражители. Основной особенностью является то, что центральную роль в изменении ионных токов играют протеин-киназы.

Рецептор фактора роста эпидермиса

Фактор роста эпидермиса является сильнодействующим митогенным белком, который связывается со специфическим рецептором, находящимся на поверхности различных эпителиальных, эпидермальных и фибробластных клеток. Рецептор представляет собой один гликозилированный полипептид с мол. массой около 170 кДа и относится к семейству митогенных рецепторов. Его N_концевая часть расположена вне клетки и является ФРЭ-связывающим доменом. Рецептор имеет единственный мембранный сегмент и большой внутриклеточный домен, обладающий тирозинкиназной активностью. ФРЭ-рецептор, как и другие рецепторные белки, содержит внеклеточные домены, богатые цистеином, но их функция неизвестна.

ФРЭ-рецептор находится на плазматической мембране в высокоаффинной и низкоаффинной формах. Возможно, это связано с существованием в мембране различных состояний ассоциации этого белка. Показано, что связывание с ФРЭ стабилизирует димерную форму очищенного рецептора в детергенте; это указывает на важность агрегации рецептора для передачи сигнала. Биохимические исследования показывают, что связывание с ФРЭ индуцирует тирозинкиназную активность, в частности аутофосфорилирование рецептора, по нескольким остаткам тирозина в цитоплазматическом домене. Как связаны между собой киназная активность и клеточный ответ, неясно. В некоторых типах клеток существует какой-то независимый механизм, с помощью которого ФРЭ влияет на фосфатидилинозитольную систему, возможно, путем стимулирования фермента, фосфорилирующего фосфатндилинозитол с образованием монофосфорилированного производного.

Рецептор ФРЭ фос-форилируется протеинкиназой С, которая десенсибилизирует рецептор и индуцирует его поглощение путем эндоцитоза. Одним из ранних событий, связанных с ФРЭ-стимуляцией клеток, является активация Na + /H +-антипортера в плазматической мембране. Это приводит к замене внутриклеточного Н+ на внеклеточный Na+ и к незначительному повышению рН. Это ранний ответ на многие митогенные агенты, и изменения рН может быть достаточно для индукции активности других клеточных ферментов. Митогенный ответ, т. е. индукция синтеза ДНК, является длительным ответом, требующим присутствия ФРЭ во внешней среде в течение нескольких часов. Механизм этого явления остается непонятным.

ФРЭ-рецептор поглощается путем рецепторзависимого эндоцитоза. Исходно рецепторы распределены в плазматической мембране случайным образом, но при связывании ФРЭ комплекс рецептор/ФРЭ концентрируется в окаймленных ямках, поглощается и попадает в лизосому, где происходит его деградация. Это очищает поверхность с эффективностью примерно 80% рецепторов за 20 мин. Латеральная подвижность рецептора, измеренная с помощью метода FRAP, составила 1,5-10~ 10 см2-с * ', что указывает на существование каких-то препятствий при его латеральном движении. Мутанты, у которых отсутствует большая часть цитоплазматического домена, тоже диффундируют медленно, из чего следует, что этот домен не связан с с уменьшением латеральной подвижности. Возможно, для этого важны взаимодействия с компонентами внеклеточного матрикса. Однако цитоплазматический домен необходим для эндоцитоза, как и у других рецепторов. Делеция 63 аминокислотных остатков с С-конца приводит к потере рецептором сайта аутофос-форилирования и высокого сродства к ФРЭ. Тем не менее, этот рецептор остается способным к эндоцитозу и обладает митогенными свойствами.

Мутагенез очень полезен для выяснения механизма функционирования рецепторов, но важным фактором, который пока не удалось выяснить, является степень ассоциации рецептора в мембране. Это особенно интересно для тех рецепторов, которые имеют единственный спиральный трансмембранный сегмент, с точки зрения передачи конформационного изменения во внеклеточном агонист-связывающем домене к внутриклеточному тирозинкнназному домену через единственную спираль. Вряд ли связывание ФРЭ изменяет геометрию спирали; спираль не может также «скользить» вдоль другой спирали внутри трансмембранного домена, если рецептор имеет один трансмембранный сегмент. Возможно, связывание ФРЭ изменяет белково-липидные взаимодействия, благодаря которым спираль может проталкиваться через бислой. Другая возможность - изменение степени агрегации рецепторов при связывании с ФРЭ; об этом свидетельствует изучение выделенных белков.

d_Адренвргический рецептор

Многие важные особенности /9_адренергических рецепторов мы уже обсуждали. Несколько таких рецепторов было клонировано; при этом было показано, что они структурно сходны с семейством опсинов, в том числе родопсином, и с мускарииовыми холинергическими рецепторами. По-видимому, все эти белки имеют по семь трансмембранных спиралей; экспериментальное подтверждение этому было получено для родопсина. Консервативные остатки этих рецепторов локализованы главным образом в гидрофобных областях, а не в гидрофильных петлях, соединяющих трансмембранные сегменты. Среди этих консервативных остатков в трансмембранных сегментах находится несколько полярных остатков. Заметим, что эти белки негомологичны бактериоро-сопсину.

Ретинальсвязывающий сайт родопсина находится в гидрофобном ядре, образуя шнффово основание с остатком лизина в спирали VII. Было бы заманчиво предположить, что агонистсвязывающий сайт в /3_адренергическом рецепторе также локализован в гидрофобном ядре. Для проверки этого предположения был проведен сайт-специфический мутагенез /3_адренергического рецептора хомяка. Полученные результаты свидетельствуют о том, что гидрофильные петли несущественны для связывания агониста или антагониста, а также показывают, что для связывания агониста необходим остаток аспартата в положении 113, находящийся в спирали III. Не являются неожиданностью полученные в этих работах данные о том, что, вероятно, гидрофильная петля участвует во взаимодействии с G_белком.

lgE_рвцептор мастоцитов и базофилов

Мастоциты и базофилы содержат секреторные гранулы, наполненные гистамином. При соответствующей стимуляции эти экзоци-озные везикулы сливаются с плазматической мембраной и высвобождают запасенный гистамин. Показано, что этот процесс запускается агрегацией IgE_рецепторов клеточной поверхности, которая индуцируется связыванием либо с IgE, либо с другими лиган-дами, сшивающими рецепторы. IgE_система представляет особенный интерес, поскольку для нее действительно показана роль агрегации рецепторов в передаче сигнала, а кроме того, она является примером системы, связанной с деградацией фосфатидилинозитола, которая инициируется G_белком.

IgE_рецептор представляет собой а/372_тетрамер; он был очищен, а ген а-субъединицы - клонирован и секвенирован. Эта субъединица гомологична Fc_рецептору IgG, который относится к иммуноглобулиновому суперсемейству. В отсутствие сшивающего лиганда IgE_рецепторы распределены в мембране равномерно и обладают ограниченной подвижностью. Каждый рецептор может связать одну молекулу IgE, и ответ возникает только под действием мультимерных форм IgE, которые способны связывать несколько рецепторов одновременно. Олигомеры, содержащие лишь несколько молекул IgE, вызывают быструю иммобилизацию рецепторных кластеров, которая, по-видимому, осуществляется благодаря последовательным взаимодействиям с элементами цитоскелета и не может определяться простой гидродинамикой. В результате всех этих событий запускается клеточный ответ, при котором образуются фосфоинози-тиды и арахидоновая кислота, мобилизация Са2+ и секреция гистамина. Этот ответ ингибируется коклюшным токсином, по-видимому, при участии G_белка.

7. Онкогены и передача сигнала

Рецепторы и механизм передачи сигнала играют существенную роль в регуляции клеточного роста и дифференцировки. Те же факторы, как показывают молекулярно-генетические исследования, участвуют в процессах перерождения опухолей. Наилучшими экспериментальными моделями явились онкогены ретровирусов. Было показано, что за опухолевую трансформацию инфицированных клеток отвечают 20 разных ретровирусных генов, называемых онкогенами. Эти онкогены в большинстве случаев имеют клеточные аналоги. Например, белок, кодируемый вирусным онкогеном v-erbB, является укороченным вариантом ФРЭ-рецептора. В этом случае вирусный онкоген родствен клеточному гену, кодирующему ФРЭ-рецептор. Такие клеточные гены называются протоонкогенами. Используя способность онкогенов трансформировать клетки в культуре, удалось выделить их также из ДНК опухолевых клеток. Онкогены появляются в результате генетических повреждений в протоонкогенах. Около половины протоонкогенов, идентифицированных по гомологии с вирусными онкогенами, тоже были выявлены при изучении опухолей. Однозначной корреляции между видом онкогена и возникающей опухолью или характером нарушения функционирования клетки не обнаружено. Существует гипотеза, что протоонкогены кодируют белки, которые участвуют в передаче сигнала, опосредуемой мембранами, или являются мишенями для вторых посредников.

Продукты некоторых идентифицированных онкогенов обладают тирозинспецифичной протеинкиназной активностью и являются аналогами мембранных рецепторов для митогенных пептидов и гормонов роста. Сверхэкспрессия онкогена, изменение специфичности для белковых субстратов или изменение регуляции активности могут приводить к патологии. Протоонкоген может превратиться в онкоген в результате простых точечных мутаций. Продукты не всех онкогенов, обладающие тирозинкиназной активностью, являются трансмембранными белками, некоторые из них представляют собой периферические мембранные белки.

Онкогенные белки типа v-res гомологичны а-субъединице G_белков. Соответствующие гены представляют собой модификации гена, кодирующего G_белок, который стимулирует фосфатидилинозитольную систему. Показано, что введение этих онкогенов в геном приводит к повышению уровня диацилглицерола, хотя содержание растворимых фосфоинозитидов при этом не увеличивается. Как это связано с трансформацией - неизвестно. Отметим, что форболовые эфиры ускоряют образование опухолей, и эта функция, вероятно, связана с активацией протеинкиназы С.

Наиболее существенно то, что нарушение аппарата передачи сигнала может индуцировать рак. Изучение этой закономерности может оказаться полезным не только для установления механизмов возникновения опухолей, но и для выявления сложной сети взаимодействий в системе передачи сигнала, ответственной за нормальную клеточную пролиферацию и дифференцировку.

Резюме

Взаимодействия клетки с ее окружением осуществляются при участии рецепторов, расположенных на ее поверхности. Функции этих рецепторов существенно различаются. Одни из них определяют адгезивные свойства клеток по отношению к другим клеткам или компонентам внеклеточного матрикса. Другие участвуют в системах сигнал / ответ или в импорте макромолекул в цитоплазму.

Сравнение аминокислотной последовательности рецепторов показывает, что многие из них могут быть сгруппированы в суперсемейства структурно родственных, но функционально различающихся белков. Например, многие рецепторы, участвующие в межклеточной адгезии, принадлежат к суперсемейству иммуноглобулинов IgG. Интегрины составляют другое суперсемейство, включающее в себя множество рецепторов для внеклеточных компонентов матрикса.

Рецептор, который связывается с таким внеклеточным лигандом, как гормон или нейромеднатор, и опосредует клеточный ответ, осуществляет это одним из нескольких способов. В одних случаях рецептор сам является протеинкиназой, а в других он образует ионный канал. Связывание лиганда с внеклеточным участком рецептора изменяет эти функции, инициируя каскад событий в цитоплазме. В других случаях рецептор связывается с гуанидиннуклео-тидсвязывающим белком и активирует его в цитоплазме в ответ на внешний сигнал. G_белок влияет на другие клеточные процессы, такие, как деградация фосфатидилинозитола в клеточной плазматической мембране. Рецепторы, которые взаимодействуют с G_белками, образуют одно из нескольких суперсемейств рецепторов, участвующих в системах сигнал / ответ.

Важно помнить, что поверхность животной клетки очень динамична и плазматическая мембрана участвует в удивительном явлении, называемом рециклированием мембран. Внутриклеточные везикулы постоянно сливаются с плазматической мембраной, а участки плазматической мембраны в свою очередь отшнуровываются с образованием внутриклеточных везикул. Эти процессы составляют часть эндоцитозного и экзоцитозного путей.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5


ИНТЕРЕСНОЕ



© 2009 Все права защищены.