Идентификация генов биосинтеза эктоина у метилотрофной бактерии Methylarcula marina

p align="left">N-ацетилированые диаминокислоты (ацетилорнитин, ацетиллизин);

амидные производные глутамата (N-карбамоилглутамиламид);

эктоины (эктоин, гидроксиэктоин);

метилированые сульфосоединения (диметилсульфониопропионат), накапливающиеся у цианобактерий и морских водорослей.

Эти исследования привели к ряду важных обобщений:

1. Синтезируемые de novo полиолы, такие как глицерин, арабит, инозит, часто накапливаются у галофильных и галотолерантных грибов, устойчивых к солям растений, но не обнаружены у галофильных бактерий.

2. Все “совместимые вещества”, синтезируемые или транспортируемые из среды, накапливаются в концентрациях, превышающих 500 мМ, и являются полярными, хорошо растворимыми молекулами, не несущими суммарного заряда.

3. Заряженные аминокислоты, такие как глутамат, -глутамат, бетаинглутамат и другие, не накапливаются в очень больших количествах (более 400 мМ).

Осмолиты могут быть разделены на основании затрачиваемой клеткой энергии для их биосинтеза (Oren, 1999). При этом наиболее энергетически выгодным является биосинтез глицерина, эктоина и глицин-бетаина, наименее выгоден синтез сахарозы и трегалозы. Многие бактерии способны накапливать одновременно ряд осмопротекторов, при этом преобладание того или иного осмолита во многом определяется энергетическим статусом клетки и доступностью источника азота.

Все вышеперечисленные группы осмолитов можно разделить на три химические категории: 1) анионные растворимые вещества, 2) незаряженные растворимые вещества и 3) цвиттерионые растворимые вещества. В таблице 1 приведены распространенные у микроорганизмов совместимые растворимые вещества.

		Распространение у микроорганизмов	литература
Анионные органические осмолиты, содержащие карбоксильную группу
б-Глутамат		E. coli; Halomonas elongata; Methanohalophilus portucalensis; Methanobacterium thermoautotrophicum; Natronococcus occultus; Halobacterium sp.NRC-1 и H. salinarum; Erwinia chrysanthemi а также многие галотолерантные бактерии и метаногены	Roberts, 2004 Goude et al., 2004
в-Глутамат		Methanothermococcus thermolithotrophicus; Methanocaldococcus jannaschii; Methanotorris igneus; Nocardiopsis halophila, у всех видов Nocardiopsis, Thermotoga neapolitana и T. maritime	Galinski and Truper,1994; da Costa et al., 1998; Martin et al., 1999
Глутаматбетаин		Calothrix sp. N181	Mackay et аl., 1984 Roberts, 2004
б-Гликозил-глицерат		Agmenellum quadruplicatum; Stenotrophomonas maltophilia; Methanohalophilus portucalensis Erwinia chrysanthemi	Roberts, 2004 Goude et al., 2004
б-Маннозил-глицерат		Dehalococcoides ethenogenes; Methanothermus fervidus; Pyrococcus furiosus; Rhodothermus marinus и R. obamensis; Methanohalophilus portucalensis; Thermus thermophilus; Dehalococcoides ethenogenes; Rubrobacter xylanophilus; Aeropyrum pernix; Pyrococcus sp.; Thermococcus sp.; Archaeoglobus fulgidus	Empadinhas et al., 2004 Santos and da Costa, 2002 Martins et all., 1999; Goncalves et all., 2003 Lamosa et all., 1998; Neves et all., 2005
Анионные органические осмолиты, содержащие фосфатные или сульфатные группы
Ди-мио-инозит-1,1'-дифосфат		Archaeoglobus fulgidus; Methanotorris igneus; Pyrococcus furiosus и P. woesei; Pyrodictium occultum; Thermotoga maritima	Martin et al., 1999; Roberts, 2004 Santos and da Costa, 2002 Martins et all., 1997 Martins et all., 1996
б-Диглицерин- фосфат		Archaeoglobus fulgidus	Martins et all., 1997 Goncalves et all., 2003
Цикло-2,3-дифосфоглицерат		Methanobacterium thermoautotrophicum; Methanopyrus kandleri; Methanothermus fervidus	Martins et all., 1997
Сульфотрегалоза		Natronococcus occultus; Natronobacterium sp.	Desmarais et al., 1997
Незаряженные органические осмолиты
Гликозил-глицерин		Морские и пресноводные цианобактерии: Synechocystis sp., Microcystis firma; фототрофные эубактерии: Rhodobacter sulfidophilum; Pseudomonas mendocina и P. рseudoalcaligenes; Stenotrophomonas sp.	Reed et al., 1986 Galinski, 1995; da Costa et al., 1998
б-маннозил-глицерамид		Rhodothermus marinus и R. obamensis	Silva et al., 1999
Трегалоза		Pyrobaculum aerophilum; Sulfolobus solfataricus и S.ambivalens; Thermoproteus tenax; Thermoplasma acidophilum; Actinopolyspora halophila; Scytonema species cемейства Thiocapsa, Thiocystis, Chromatium, а также Azotobacter chroococcum, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Rhizobium meliloti, Chromohalobacter israelensis; Desulfovibrio halophilus; Rhodothermus obamensis; Narialba magadii T. Thermophilus; Sinorhizobium meliloti	Galinski, 1995; da Costa et al., 1998 Page-Sharp et al., 1999 Nunes et all., 1995; Elbein et all., 2003 Goufii et all., 1999
Сахароза		Synechocystis sp., Anabaena sp., Phormidium autumnale; Scytonema species; Chroococcidiopsis sp. Sinorhizobium meliloti	Reed et al., 1986; Hershkovitz et al., 1991; Page-Sharp et al., 1999; Desplats et all., 2005.
N-карбамоил-L-глутамин-1-амид		Ectothiorhodospira marismortui	Oren et al., 1991.
N-б-ацетил-глутаминил-глутаминамид		Sinorhizobium meliloti; Rhizobium leguminosarum; Pseudomonas aeruginosa; пурпурные сульфобактерии Rhizobium meliloti, P. fluorescens, P. aeruginosa, P. putida, P. mendocina	Smith and Smith, 1989; D'Souza-Ault et al., 1993; Kets et al., 1996.
Манносахароза		Agrobacterium tumefaciens	Smith et al., 1990
Цвиттерионые органические осмолиты
Глицинбетаин		Thioalkalivibrio versutus; Actinopolyspora sp.; Actinopolyspora halophila; Halorhodospira halochloris; Methanohalophilus portucalensis FDF1; Methanosarcina thermophila; Methanothermobacter marburgensis; Synechococcus sp. DUN52, B. subtilis E. coli, Staphylococcus xylosus Sinorhizobium meliloti, Halomonas elongata Methanobacterium thermoautotrophicum Marburg Ectothiorhodospira halochloris, Actinopolyspora halophila, галотолерантный фототроф Aphanothece halophytica Methanohalophilus portucalensis; Listeria monocytogenes	Lai et al., 1991 Boch et al., 1996, Osteras et al., 1998, Canovas et al., 2000, Nyyssola et al., 2000, Waditee et al., 2003 Bayles et all., 2000
Эктоин		Sporosarcina pasteurii; Bacillus pasteurii; Marinococcus halophilus; Brevibacterium epidermis, B. linens; Thioalkalimicrobium aerophilum; Vibrio cholerae и V.costociola; Chromohalobacter israelensis и C. salexigens; Halorhodospira halochloris; Halomonas elongata H. israelensis, H. variabilis; метилотрофы: Methylomicrobium alcaliphilum, Mm. keniense, Mm. buryatense; Methylophaga alcalica и M. natronica, Methylarcula terricola и M. marina; и многие галотолерантные бактерии	Canovas et al., 1997; Wohlfarth et al., 1990 Khmelenina et al., 1999 Doronina et all., 2000; Doronina et all., 2003a, b
Гидроксиэктоин		Halomonas elongata; Chromohalobacter salexigens; Nocardiopsis halophila; N. dassonvillei; Micrococcus halobius; Marinococcus halophilus, Marinococcus sp. M52; Brevibacterium casei, B. iodinum, B. linens, Streptomyces chrysomallus, S. griseolus; Salibacillus salexigens	Roberts, 2004 Frings et al., 1993 Severin et al., 1992
Nе-ацетил-в-лизин		Methanothermococcus thermolithotrophicus; Methanosarcina thermophila, M. mazei Go1, M. acetivorans. M. barkeri; Meyhanococcus jannaschii и M. maripaludis; Methanohalophilus portucalensis FDF1; Halobacillus halophilus Methanosarcina thermophila, Methanogenium cariaci, Methanohalophilus sp. и Methanococcus sp. Sporosarcina halophila, Planococcus citreus	Pfluger et al., 2003 Martin et al., 1999; Roberts, 2004 da Costa et al., 1998
в-глутамин		Methanohalophilus portucalensis FDF1	Roberts, 2004
Пролин		B. subtilis и Planococcus citreus, Azospirillum brasilense некоторых видов Staphylococcus и Salinicoccus	Kempf et all., 1998 Miller et all., 1996
Диметил-сульфонио-пропионат		Морские водоросли; поглощается из среды E. Coli, S. typhimurium	Galinski, 1995; Welsh, 2000 Cosquer et. al., 1999; Pichereau et al., 1998
Пипиколиновая кислота		Brevibacterium ammoniagenes, Sinorhizobium meliloti	Gouesbet et al., 1992 Gouffi et al., 2000
Карнитин		Поглощаются из среды: E. coli, Lactobacillus plantarum, Listeria monocytogenes, Pediococcus halophilus, Brevibacterium linens, Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes	Sleator, Hill, 2001 Kets et al., 1994 Bayles et all., 2000 Jebbar et al., 1998

52

Глава 2 Биосинтез эктоина и гидроксиэктоина

Эктоин как осмоактивное вещество впервые обнаружен Э. Галинским у фототрофной пурпурной бактерии Ectothiorhodospira halochloris (Galinski et al., 1985). По химической структуре эктоин может быть классифицирован как частично гидратированная иминокислота (1,4,5,6-тетрагидро-2-метил-4-пиримидин карбоксилат).

Накопление эктоина показано для различных галофильных и галотолерантных Г+ и Г эубактерий, включая виды Nocardiopsis, Brevibacterium и Marinococcus, а также Halomonas, Pseudomonas и Vibrio (табл.1). Интересно отметить, что негалофильные эубактерии накапливают эктоин, транспортируя его из среды в гиперосмотических условиях (Jebbar et al., 1992, 2005; Peter et al., 1998, Malin and Lapidot, 1996).

2.1 Гены и ферменты биосинтеза эктоина и гидроксиэктоина

Путь биосинтеза эктоина, является ответвлением в пути синтеза аминокислот аспартатного семейства. В этом пути аспартат--полуальдегид (AПA) превращается в L-2,4-диаминобутират (ДАБ) с участием ДАБ-аминотрансферазы, ДАБ ацетилируется в N-ацетил-2,4-диаминобутират (АДАБ) при участии ДАБ-ацетилтрансферазы. Циклизация АДАБ в эктоин катализируется эктоинсинтазой (Peters et al., 1990). Данный путь подтверждён энзиматически для фототрофа Ectothiorhodospira halochloris (Peters et al., 1990), гетеротрофов Halomonas elongata (Canovas et al., 1998), Halobacillus dabanensis (Zhao et al., 2006), Bacillus pasteurii (Kuhlmann and Bremer, 2002) и морской бактерии Marinococcus halophilus (Louis and Galinski, 1997) (Рис. 1).

У Brevibacterium linens (Bernard et al., 1993), Brevibacterium epidermis DSM 20659 (Onraedt et al., 2004), Brevibacterium sp. (Nagata et al., 1998), Streptomyces parvulus (Inbar and Lapidot, 1988) путь биосинтеза эктоина начинается с глутамата. Кроме аспартата и глутамата, в качестве предшественника может использоваться аспарагин, как показано для Streptomyces griseus и Streptomyces clavuligerus (Malin and Lapidot, 1996).

Гены биосинтеза эктоина охарактеризованы у грамположительных умеренно галофильных бактерии Marinococcus halophilus (Louis and Galinski, 1997), Bacillus pasteurii (Kuhlmann and Bremer, 2002), Halobacillus dabanensis (Zhao et al., 2006), грамотрицательных бактерий Chromohalobacter salexigens (ранее Halomonas elongata DSM 3043) (Canovas et al., 1997) и Halomonas elongata (Canovas et al., 1998) и расположены в одном опероне ectABC, где ген ectА кодирует L-2,4-ДАБ-ацетилтрансферазу, а гены ectВ и ectС кодируют L-2,4-ДАБ-аминотрансферазу и L-эктоинсинтазу, соответственно. Таким образом, путь биосинтеза эктоина достаточно консервативен в отношении ферментов и организации ect-генов.

52

Рис. 1. Путь биосинтеза эктоина и гидроксиэктоина у галотолерантных бактерий (по Peters et al., 1990; Galinski, 1995; Ventosa et al., 1998). EctA - ДAБ-ацетилтрансфераза, EctB - ДAБ-аминотрансфераза, EctC - эктоинсинтаза и EctD - эктоингидроксилаза.

Биосинтез гидроксиэктоина осуществляется непосредственным гидроксилированием эктоина эктоингидроксилазой (EctD). К настоящему моменту ген ectD идентифицирован у Streptomyces chrysomallus (Prabhu et al., 2004), Chromohalobacter salexigens (Garcia-Estepa et al., 2006) и Salibacillus salexigens (Bursy et al., 2007).

Возможно, существует также альтернативный путь, в котором N-ацетил-ДАБ превращается в гидроксиэктоин через 3-гидрокси-N-ацетил-ДАБ без участия эктоина (Canovas et al., 1999). Но этот путь энзиматически не подтвержден.

Ферменты биосинтеза эктоина. Ферменты биосинтеза эктоина были очищены из H. elongata и частично охарактеризованы (Ono et al., 1999). 2,4-ДAБ-аминотрансфераза является гомогексамером с молекулярной массой субъединицы 44 кДа. ДAБ-аминотрансфераза является пиридоксальфосфат-зависимым ферментом, и требует присутствия ионов К+ для активности и стабильности, что обусловлено возможным наличием в белке специфических связывающих участков для этого иона. Зависимость от калия установлена для многих ферментов галофильных архей и эубактерий (Toney et al., 1995). ДАБ-аминотрансфераза H. elongata специфична к L-глутамату как донору аминогрупп, рНopt - 8.6-8.7, Км для L-глутамата 9.1 мМ, для D,L-аспартатполуальдегида 4.5 мМ. Изоэлектрическая точка рI = 6.2.

В настоящее время превращение аспартатполуальдегида в ДАБ известно у нескольких не синтезирующих эктоин бактерий - Xanthomonas sp. и Acinetobacter baumannii (Ikai and Yamamoto, 1997; Rao et al., 1969). ДАБ-аминотрансфераза из А. baumannii участвует в биосинтезе компонента клеточной стенки -1,3-диаминопропана. Этот фермент также специфичен к аспартатполуальдегиду как акцептору аминогрупп и L-глутамату как донору аминогрупп, обладает сходными с ферментом из H. elongata значениями рН оптимума, Км для ДАБ и 2-оксоглутарата (Ikai and Yamamoto, 1997). Однако, в отличие от ферментов из H. elongate и А. baumannii, ДАБ-аминотрансфераза из Xanthomonas sp., использует L-аланин как донор аминогрупп (Rao et al., 1969).

ДАБ-ацетилтрансфераза из H. elongata была очищена в 400 раз, однако в гомогенном состоянии фермент получить не удалось вследствие его нестабильности. Кинетические константы также не определены. Молекулярная масса фермента, определенная гель фильтрацией, составила около 45 кДа (Ono et al., 1999).

Эктоинсинтаза была очищена до гомогенного состояния в присутствии 1 мМ ДАБ и 2 М NaCl в качестве стабилизаторов. Фермент является гомодимером с молекулярной массой субъединицы 19 кДа, но в буфере с высокой осмолярностью (0.5 М NaCl), использовавшемся при гель-фильтрации, активность фермента не найдена. Поэтому неясно, действительно ли нативная эктоинсинтаза имеет молекулярную массу 35 кДа и является гомодимером, или имела место неспецифическая агрегация мономеров в присутствии высокой концентрации соли. Анализ аминокислотного состава эктоинсинтазы выявил повышенное содержание L-аспартата и L-глутамина. Фермент весьма специфичен к AДAБ, по-видимому, N-ацетильная группа в -положении не участвует в циклизации молекулы. Изоэлектрическая точка фермента (рI) составила 4.2 - 4.4. Предполагается, что лимитирующим звеном биосинтетической последовательности эктоина является синтез ДАБ с участием ДАБ-аминотрансферазы. Это подтверждает факт отсутствия ДАБ в клетках H. elongata KS3 (Ono et al., 1998).

Все три фермента пути синтеза эктоина у H. elongatа имеют близкие параметры для проявления максимальной активности: рН 8.2 - 9.0, t = 15 - 20?С и 0.4 - 0.5 М NaCl. Тем не менее, ДАБ-аминотрансфераза более активна в присутствии 0.01 - 0.5 М KCl, чем при тех же концентрациях NaCl (Ono et al., 1999). Оптимальные концентрации соли для активности трёх ферментов ниже, чем предполагалось исходя из галотолерантности H. elongata DSM2581, что, очевидно, связано с относительно низкой внутриклеточной концентрацией свободных ионов. Так, внутриклеточный уровень Na+ в клетках галофильных эубактерий Vibrio costicola и Brevibacterium sp., растущих в присутствии высокой концентрации NaCl, составлял 0.04 - 0.2 М (Gilboa et al., 1991; Nagata et al., 1995).

Недавно эктоингидроксилаза была очищена из Salibacillus salexigens и частично охарактеризована (Bursy et al., 2007). Фермент представляет собой мономер (М.м. 34 кДа) с оптимумами рН и температуры 7.5 и 32°C, соответственно. Эктоингидроксилаза S. salexigens является 2-оксоглутарат-зависимым ферментом и требует присутствия молекулярного кислорода в реакционной смеси. В активный центр эктоингидроксилазы входит одна молекула Fe(II), поэтому авторы отнесли данный белок к суперсемейству негемсодержащих Fe(II)- и 2-оксоглутарат-зависимых диоксигеназ (EC 1.14.11). Максимальная активность фермента составила 13.8 Е/мг, Kм для эктоина и 2-оксоглутарата составили 3.5 ± 0.2 и 5.2 ± 0.2 мM, соответственно (Bursy et al., 2007).

Глава 3 Осмоадаптация аэробных метилотрофных бактерий

Аэробные метилотрофные бактерии используют метан (метанотрофы), его окисленные или замещенные производные (метилобактерии) в качестве источников углерода и энергии. Большинство коллекционных культур метанотрофов до конца 80-х годов были представлены нейтрофильными негалофильными штаммами, растущими при pH 6.5-7.5 и низкой солености (менее 0.5% NaCl). Исключение составляли морские метанотрофы, растущие при солености до 3% NaCl (Гальченко и др., 1986).

Первый солезависимый метанотроф Methylomicrobium pelagicum был выделен из Саргассова моря (Sieburth et al., 1987), но вскоре утерян, позднее, из образцов ила щелочных озер Тувы удалось выделить галотолерантный алкалофильный метанотроф Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, оптимально растущий при рН 9.0 в присутствии 4% NaCl с верхней границей галотолерантности при 9% NaCl (Хмеленина и др., 1996). Из гиперсоленого (14% NaCl) озера Сасык-Сиваш был выделен умеренно галофильный нейтрофильный метанотроф Methylomicrobium modestohalophilum 10S, растущий при pH 5.5-8.5 и солености от 0.2 до 9% (Калюжная и др., 1998), а также Methylohalobius crimeensis, устойчивый к 15% NaCl (Heyer et al., 2005), из содовых озер Южного Забайкалья были выделены пять штаммов облигатных метанотрофов Methylomicrobium buryatense, которые являются алкалотолерантыми галофилами (штаммы 4G, 5G и 6G) или галотолерантными факультативными алкалофилами (штаммы 7G и 5B) (Калюжная и др., 1999; Kalyuzhnaya et al., 2001; 2008).

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5