Эколого-физиологические особенности микроскопических грибов представителей рода Aspergillus, выделенных из разных местообитаний

p align="left">Разложение сахаров. В клетку часто проникают моносахариды - продукты внеклеточного разложения полисахаридов; ди- и олигосахариды также поглощаются из окружающей среды и включаются в метаболизм. Необходимые для этого ферменты либо широко распространены (мальтоза, сахароза и так далее), либо обнаружены у более или менее многих представителей грибов (Lodder, 1970; Barnett, 1979).

Наиболее обычный источник углерода - глюкоза. Полное разложение одного ее моля дает 675 ккал энергии. Другие гексозы (глюкоза - не обязательно) включаются в универсальный процесс разложения только после фосфорилирования; этим же путем идут продукты расщепления внеклеточных полисахаридов, запасных и входящих в состав клеточной стенки макромолекул.

Первая реакция разложения гексоз протекает с использованием энергии по общей формуле:

Гексоза + АТФ > Гексозофосфат +АДФ.

При этом с участием фермента гексокиназы из глюкозы, фруктозы и маннита возникают соответствующие гексозо-6-фосфаты, а из галактозы под действием галактокиназы - галактозо-1-фосфат, который затем изомеризуется. Разложение сахаров протекает в грибной клетке следующими основными путями.

Фруктозодифосфатный путь (ФДФ, гликолиз, путь Эмбдена-Мейргофа-Парнаса) может вести к полному окислению, неполностью окисленным конечным продуктам или ответвляться в сторону образования сырья для биосинтеза. Гликолитические реакции в клетке начинаются с фосфорилирования глюкозы (в форме фосфатов сахара более рекционноспособны). При трансформации глюкозы в пировиноградную кислоту по пути Эмбдена-Мейргофа-Парнаса выделяется свободная энергия, достаточная для образования четырех молекул АТФ. Однако две из них требуются для превращения глюкозы в фруктозо - 1,6-дифосфат, и только две молекулы АТФ остаются для процессов синтеза.

Пентозофосфатный путь (ПФ) либо поставляет промежуточные продукты для последующего биосинтеза, в том числе нуклеотидов, либо продолжается по типу ФДФ.

При разложении через 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконовую кислоту (КДФГ, путь Энтнера-Дудорова =ЭД) продукты расщепления КДФГ, образующейся путем дегидратации 6-фосфоглюконовой кислоты (глицеральдегидфосфат, пировиноградная кислота; быстро и непосредственно попадают в систему гликолиза).

С помощью глюкооксидазы (ГО) некоторые виды Aspergillus и Penicillium окисляют непосредственно глюкозу до глюконовой кислоты, которая выделяется в среду или включается в ПФ; возникающая при этом ядовитая для всех организмов перекись водорода ферментативно разрушается.

В глиоксилатном цикле (ГЦ) - побочном пути цикла лимонной кислоты (ЦЛК) - изолимонная кислота, возникающая из ацетил - кофермента А и щавелевоуксусной кислоты, превращается в янтарную и глиоксиловую кислоты; последняя, реагируя с ацетил - коферментом А, дает яблочную кислоту, позволяющую продолжаться ЦЛК. Недостаток субстрата для ЦЛК может возникать, например, из-за расходования ? - кетоглутаровой кислоты для синтеза аминокислот, тогда глиоксилатный путь заменяет отсутствующие промежуточные звенья (реакции пополнения, анаплеротические последовательности). Глюкоза и продукты ее разложения стимулируют нормальное протекание ЦЛК и подавляют ГЦ, который может активироваться присутствием в среде ацетата или глицина.

Полное окисление. С помощью дыхательных ферментов процесс соединения водорода с кислородом, дающий энергию почти всем организмам, подразделяется на мелкие этапы с незначительными различиями в энергосодержании исходных веществ и продуктов («биологический взрыв гремучего газа»). В ходе этих отдельных реакций, в частности, регенерируется АТФ. Ферментные системы различных организмов, несмотря на существенные общие черты неодинаковы. Так, у оомицетов отсутствует цитохром С1, свойственный грибам и растениям, а у одного из представителей рода Aspergillus отмечен цитохром, не отравляемый цианидом - (аналогичный В-цитохрому растений).

Доступность и использование различных путей разложения углеводов. То, какой путь задействован, зависит от организма, среды и состояния клетки, например от активности ее ферментов. Для определения этого количественно оценивают превращения субстрата соответствующими ключевыми ферментами.

Полиолы. Многоатомные спирты (полиолы), например маннит, рибит, глицерин, - результат окисления глюкозо-фосфата или соответствующих предшественников, конкурентного глюконеогенезу, спиртовому брожению или полному окислению в ЦЛК, а также синтезу макромолекул или другим реакциям с использованием АТФ и восстановлением НАДФ. Возможно, полиолы вместе с трегалозой служат у грибов формой транспорта углерода в гифах; они способны регулировать восстановительную силу, энергоснабжение, осмотические условия, содержание запасных веществ и рост. Некоторые авторы считают состав полиолов у грибов важным таксономическим признаком: у хитридиомицетов, аскомицетов, базидиомицетов и дейтеромицетов преобладает маннит, у зигомицетов его нет или же он не относится к главным компонентам; в целом у грибоподобных протистов полиолов меньше, чем у настоящих грибов. Наряду с такими наиболее частыми многоатомными спиртами, как глицерин (почти у всех) и манит (у всех грибов, кроме ряда зигомицетов), обнаружены также эритрит, рибит и арабит, известные и у водорослей. Концентрация рибита у Mucorales (Zygomycetes) зависит от питания (рост при потреблении рибозы). Арабит в крови человека указывает на грибную инфекцию (например, поражение Candida albicans); у здоровых людей он отсутствует. Здесь также выделяются оомицеты, у которых не обнаружено никаких полиолов; некоторые другие группы низших грибов (грибоподобных протистов) до сих пор изучены в этом плане недостаточно (Мюллер, 1995).

1.3.2 Разложение трудноразлагаемых веществ

Плесневые грибы в качестве источника углерода могут использовать такие трудноразлагаемые вещества, как целлюлоза, крахмал, лигнин, пектиновые вещества, нефть, пестициды.

Разложение целлюлозы. Основными источниками целлюлозы для грибов в природных условиях служат древесина и различные растительные остатки. Среди микроскопических грибов, разлагающих целлюлозу известны представители следующих родов: Aspergillus, Coriolus, Eupenicillium, Fusarium, Penicillium, Sporotrichum, Trichoderma, Verticillium. Но только некоторые из них продуцируют полные внеклеточные целлюлолитические системы (эндо- и экзоглюканазы ?-глюкозидазу). Среди них Trichoderma viride, T. reesei, T. koningii, Penicillium funiculosum, Fusarium solani. Для культуральной жидкости большинства других грибов этой группы характерно отсутствие экзоглюканазы, то есть эти грибы могут деградировать более аморфные формы целлюлозы.

Деградация высокоупорядоченной формы целлюлозы осуществляется благодаря синергическому действию комплекса целлюлолитических ферментов. При любой комбинации экзо- и эндоглюканаз Trichoderma koningii, Fusarium solani, Penicillium и Funiculosum отмечается выраженный синергизм. Однако синергизм между экзоглюканазами этих грибов и эндоглюканазами грибов, не продуцирующих экзоглюканазу (Myrothecium verrucaria), не выявлен. Нет также синергизма между экзоглюканазами грибов и эндоглюканазами рубцовых бактерий. Последнее указывает на существенные различия целлюлолитических систем грибов и бактерий (Марьиновская, 2006).

Целлюлоза является линейным полимером d-глюкозы. Остатки глюкозы в молекуле клетчатки, как и в молекуле целлобиозы связаны ?-гликозидной связью. Поэтому клетчатку можно рассматривать как полимер целлобиозы. Нормэн и Фуллер (1942) считают, что большинство грибов способно усваивать клетчатку. Несмотря на то, что использование клетчатки грибами имеет большое значение в круговороте веществ в природе, процесс этот изучен далеко не полно.

Обычно считают, что первым этапом использования целлюлозы грибами является ее гидролиз. Гидролиз целлюлозы можно схематически представить следующим образом: целлюлоза > целлодекстрины > целлотетроза > целлобиоза > d-глюкоза. Известен штамм Aspergillus oryzae, выделяющий целлюлазу и целлобиозу (Лилли, 1957).

Разложение крахмала. Как и целлюлоза, крахмал является полимером d-глюкозы. Остатки глюкозы в его молекуле соединены между собой ?-гликозидной связью, поэтому основной структурной единицей молекулы крахмала, как и молекулы гликогена, следует считать мальтозу. Зеленые растения синтезируют крахмал, животные и грибы образуют гликоген. Ферментативный гидролиз крахмала может быть схематически представлен следующим образом: крахмал>декстрины>мальтоза>d-глюкоза. Декстрины, имеющие разветвленную углеродную цепочку, лишь частично гидролизуются амилазой. Декстрины с неразветвленной углеродной цепочкой полностью превращаются в мальтозу (Мирчинк, 1988).

Крахмал нерастворим в воде. Лишь грибы, образующие амилазу, обладают способностью усваивать крахмал. Существует немало грибов, неспособных развиваться на средах с крахмалом, однако большинство из них может усваивать этот полисахарид. Было установлено, что 26 различных изученных видов и штаммов оомицетов из числа сапролегниевых усваивали как крахмал, так и продукты его гидролиза (декстрины, мальтозу и глюкозу), но не были способны ассимилировать 13 других источников углерода, включая сюда и фруктозу. Позднее А.С. Марголин (1942) показал, что 19 из 21 вида грибов, усваивающих мальтозу, обладали также способностью использовать и декстрин (Лилли, 1957).

Разложение пектиновых веществ. Среди грибов имеются активные разлагатели пектина, который является существенным компонентом растительного опада. Пектин образует в растениях межклеточное вещество, из которого состоят так называемые срединные пластинки, соединяющие между собой отдельные клетки растения. Они придают тканям прочность. Пектин представляет собой высокомолекулярное соединение углеводной природы - полисахарид, в котором метоксилированные остатки галактуроновой кислоты связаны между собой ?-1,4-глюкозидными связями.

Многие грибы образуют пектинолитические ферменты. Высокая пектинолитическая активность обнаружена у некоторых эпифитных грибов, главным образом Aureobasidium pullulans и видов Cladosporium. Пектинолитические грибы занимают значительное место среди типичных представителей лесной подстилки - это виды родов Cladosporium, Alternaria, Aposphaeria, Penicillium, фитопатогенные грибы родов Fusarium, Verticillium, Botrytis cinerea, Sclerotinia sclerotiorum.

Ферментативное разрушение пектиновых веществ в растениях имеет значение в патогенезе некоторых заболеваний. Фитопатогенные грибы разрушают пектин срединной пластинкой и пектаты в первичных клеточных оболочках, что приводит к изменению их физико-химических свойств и создает условия для внедрения паразита, а также в результате действия пектинэстеразы образуются вещества - полигалактурониды, способные закупоривать сосуды, что в конечном итоге приводит к увяданию растений.

Существенное значение разрушения пектиновых веществ грибами имеет при разложении растительного опада. Практическое использование пектиназ грибов - применение в пищевой промышленности при приготовлении фруктовых соков для их осветления, а также при мочке льна (Мирчинк, 1988).

Участвуя в разложении многих углеродсодержащих веществ растительного опада и древесины в первую очередь трудноразлагаемых полимерных соединений, где грибам принадлежит ведущая роль, они занимают значительное место в круговороте углерода, являясь поставщиками СО2 в атмосферу.

Среди грибов есть организмы, разлагающие жиры и воска, входящие в состав растительных и животных тканей. Это определяется наличием у них ферментов липаз. Наибольшей активностью липолитических ферментов обладают виды Mucor lipolyticus, Rhizopus nigricans, Aspergillus niger, Penicillium verrusum, Penicillium roquefortii. Многие выделены с поверхности растений, являясь эпифитами и способны разлагать также восковые налеты на поверхности растений.

Известна также способность грибов разлагать как алифатические, так и ароматические углеводороды. В этом отношении наибольшей активностью характеризуются грибы рода Aspergillus (Мирчинк, 1988).

Разрушение грибами нефтепродуктов. В последние десятилетия в связи с возродившимся интересом к процессам микробного превращения углеводородов были обнаружены мицелиальные грибы, деятельность которых приводит к деструкции нефти и ее производных. В настоящее время доказано, что утилизировать нефтепродукты, в том числе различные топлива, во время хранения и транспортировки способны многие виды грибов и бактерий (Андреюк, 1980).

Нефтепродукты как среда обитания грибов характеризуются рядом особенностей: 1) содержат большое количество сравнительно доступного углерода и минимальное - азота при почти недоступном пространственном расположении его в молекуле; 2) в них почти отсутствует доступная активная вода. Это оказывает существенное влияние на синтез de novo грибной клетки.

Вопросы необходимого соотношения C:N у грибов при росте на нефтепродуктах в биохимическом аспекте исследованы еще мало и уровень этих данных уже не отвечает современным представлениям о возможностях грибной клетки. Очевидно, здесь имеет место не только типичный гетеротрофный процесс, но также определенное подобие хемотрофии и автотрофии, причем стадии роста отличаются и специфичны по способности к разным типам трофики. Особенно это проявляется в период формирования репродуктивных структур (Ниязова, 1982; Бабьева, 1983). Спецификой роста грибов на нефтепродуктах является их способность распространяться на поверхности, то есть возможность использовать при этом активную воду из воздуха, а также расти в толще нефтепродуктов, то есть ограничивать свои потребности в воде за счет активной воды самих нефтепродуктов (Евдокимова 1982).

Рост грибов (кладоспориев, пенициллиев, аспергиллов и некоторых других видов и штаммов) в разных нефтепродуктах характеризуется различным типом размещения мицелиальной пленки. Наиболее типичный - на разделе фаз, однако чаще всего наблюдается еще и глубинный рост, при котором развивается не только в толще жидкости - до 20 см. Причем интересно, что рост этих штаммов при определенном соотношении нефтепродуктов и воды мало зависит от высоты слоев смеси, а также воздуха в надсубстратном пространстве. Это свидетельствует о большой возможности мицелиальных грибов выдерживать жесткие условия и приспосабливаться к потреблению необходимых для метаболизма веществ не совсем обычными биохимическими и физиологическими путями.

В настоящее время установлено, что способность окислять углеводороды нефти не является специфической чертой отдельных видов грибов. Это не редкая их особенность, а одна из физиологических функций. Однако, несмотря на большое сходство химических и физических свойств фракций нефтепродуктов, у большинства видов грибов четко проявляется избирательное отношение к их утилизации (Бабьева, 1983).

Разрушение полимерных материалов. Синтез полимеров и создание на их основе материалов, обладающих повышенной стойкостью к факторам окружающей среды и воздействию различных организмов, привел к обострению экологической обстановки из-за накопления больших объемов отходов, содержащих эти соединения в разных отраслях промышленности. В последние десятилетия во многих странах уделяется большое внимание созданию полимерных материалов и их модификаций, утилизация которых возможна под воздействием микробиоты. В качестве добавок к пластификаторам исследователи используют природные компоненты такие, как крахмал, производные целлюлозы, протеин, хитозан и так далее. На основе этих композитных полимеров ряд фирм выпускает пластики для производства изделий разового пользования, упаковки пищевых продуктов, плоских пленок и так далее, которые обладают способностью к биодеградации при компостировании и так далее (Власова, 2001; Фомин, 2001). Состав микроорганизмов, контаминирующих техногенные материалы и способных вызывать их биодеградацию, очень разнообразен как в таксономическом отношении, так и по их физиолого-биохимической активности. Среди них ведущее место занимают представители дейтеромицетов, способные развиваться на обширном сортименте материалов, содержащих соединения как природного происхождения, так и искусственного синтеза (Биоповреждения, 1987; Коваль, 1989).

Было проведено исследование О.В. Сычуговой с соавторами (2003) с целью изучения возможности роста и развития видов микромицетов на композиции пленочного сополимера этилена и винилацетата с термопластичным крахмалом.

В процессе данного исследования оценка возможности потребления разных форм крахмала тест - культурами показала, что они способны утилизировать данный источник углеродного питания. Однако динамика роста видов на разных средах при одинаковых условиях инкубации, при одной и той же навеске крахмала не одинакова, что особенно четко проявляется на 4-10-е сутки. Выявляется и некоторая разница в темпе роста видов грибов на нативном и растворимом крахмале разного происхождения, а также на средах Чапека и Гетченсона, взятых в качестве контроля (Сычугова, 2003).

Изменения морфологических признаков и образования новых структур у тест - культур на модифицированных средах при замене сахарозы на крахмал и росте на полимере не отмечаются, и они сопоставимы с параметрами, приведенными в определителях (Пидопличко, 1953; Ellis, 1971; Watanabe, 2000). Отличия выявлены у них только в темпах формирования морфологических структур. Хотя в литературе и приведены данные о влиянии субстрата на появление новых морфологических структур у грибов (Богомолова, 2001), однако, вероятнее всего, онтогенез и темпы развития определяются геномом вида, реализация программы которого зависит от влияния различных факторов (Шевцова, 1987; Долгова, 1997).

На поверхности пленки, содержащей термопластичный крахмал фиксируются сформированные пучки конидиеносцев Aspergillus niger, Paecilomyces variotii, Penicillium funiculosum, Chaetomium globosum, Trichoderma viride. Другие виды из взятого набора тест-культур не растут на данном субстрате или формируют слабое спороношение и в более поздние сроки.

Рост мицелия и формирование спороношения на композиции пленочного сополимера дает основание предполагать участие некоторых видов грибов в биодеструкции полимера из сополимеров этилена и винилацетата (СЭВА) с добавлением термопластичного крахмала (ТПК). Это дает возможность при последующих пересевах на смесях СЭВА и ТПК отобрать наиболее активные виды и их штаммы для разработки биотехнологии по его утилизации (Сычугова, 2003).

Таким образом, микроскопические грибы могут использовать в качестве источников углерода разнообразные органические вещества, тем самым являясь важными деструкторами различных природных материалов: целлюлозы, крахмала, лигнина, гемицеллюлозы, жиров, углеводородов, а также синтетических материалов, таких как пластики, пленки, упаковки пищевых продуктов и так далее.

2. Объекты и методы исследований

2.1 Объекты исследований

В качестве объектов исследования были выбраны различные виды микроскопических грибов рода Aspergillus: A. niger, A. ustus, A. terreus, A. flavus, A. fumigatus. Культуры были взяты из коллекции культур микроорганизмов кафедры «Прикладная биология и микробиология» АГТУ. Данные виды микромицетов были выделены из основных типов почв Астраханской области.

В качестве источника углерода были выбраны из легкоусвояемых - сахара: сахароза, арабиноза, ксилоза, галактоза, лактоза и мальтоза; многоатомные спирты: глицерин, сорбит, маннит; а также из полисахаридов - крахмал. Все эти источники были взяты из коллекции химических реактивов кафедры. Из трудноразлагаемых источников углерода были использованы: нефть, целлюлоза, гербицид и пестицид. Целлюлозу добавляли в среду в виде мелко нарезанной фильтровальной бумаги. Для определения способности микроскопических грибов рода Aspergillus использовать в качестве единственного источника углерода гербициды в данной работе использовали гербицид «Пиримифос-метил» или О, О-диметил-О - (2-диэтиламино-6-метилпиримидил-4) тиофосфат - это жидкость соломенного цвета, практически не растворим в воде, хорошо растворим во многих органических растворителях, неустойчив в кислой и щелочной средах, является эффективным средством для борьбы со многими насекомыми и клещами. Для определения способности микромицетов рода Aspergillus использовать пестициды в качестве источника углерода применяли дуст. Сахара, крахмал и многоатомные спирты добавлялись в среды в количестве 30 г./л, нефть - 30 мл/л, целлюлоза - 10 г./л, гербицид - 0,25 мл/л и пестицид - 0,001 г./л.

Страницы: 1, 2, 3