Дыхание растений

p align="left">Второй этап связан с регенерацией исходного метаболита -- глюкозо-6-фосфата. Из рибулозо-5-фосфата под действием эпимеразы (4) образуется ксилулозо-5-фосфат, а под действием изомеразы (5) -- рибозо-5-фосфат. Рекомбинации сахаров с участием транскетолазы (6,8) и трансальдолазы (7) приводят к появлению 3-ФГА и седогептулозо-7-фосфата, затем эритрозо-4-фосфата (7) и фруктозо-6-фосфата(8); в результате образуются фруктозо-6- фосфаты, которые изомеризуются в глюкозо-6-фосфат (12).

Как видно из рис.5, 6 молекул глюкозо-6-фосфата, участвуя в ПФП дыхания, дают 6 молекул рибулозо-5-фосфата и 6С02, после чего из 6 молекул рибулозо-5-фосфата регенерируют 5 молекул глюкозо-6-фосфата. Для каждого оборота цикла суммарное уравнение ПФП имеет следующий вид:

6 Глюкозо-6-фосфат + 12НАДФ + + 7Н20 -->5Глюкозо-6-фосфат + 6С02 + 12НАДФH + 12Н+ + Н3Р04

Энергетический выход ПФП и его роль в обмене веществ.

Универсальным донором водорода для электронтранспортной цепи дыхания служит НАДH, содержание которого в растительных тканях всегда значительно выше, чем НАДФH. В нормальных условиях НАДФ+ находится в клетках в восстановленной форме НАДФH, тогда как НАД+ -- в окисленной. Доказано, что НАДФH окисляется медленнее, чем НАДH. Если при окислении субстрата образуется НАДФH, как, например, при апотомическом окислении глюкозо-6-фосфата, то атомы водорода перед поступлением в электронтранспортную цепь должны быть переданы на. НАД+ (трансгидрогеназцая реакция). Если бы все 12 пар протонов от НАДФH, которые образуются при полном окислении молекулы глюкозо-6-фосфата по ПФП, были бы переданы через ЭТЦ на 02, то получилось бы 3 АТФ х 12 = 36 АТФ, что составляет 41,868 кДж х х 36 = 1507 кДж/моль. Практически это не уступает энергетическому выходу дихотомического пути дыхания (гликолиз и цикл Кребса), в котором образуется 1591 кДж/моль (38 АТФ,)1

Однако основное назначение ПФП состоит в участии не столько в энергетическом, сколько в пластическом обмене клеток. Это участие в пластическом обмене включает несколько аспектов:

1. НАДФH используется главным образом в различных синтетических реакциях.

2.В ходе пентозофосфатного цикла синтезируются пентозы, входящие в состав нуклеиновых кислот и различных нуклеотидов (пиридиновых, флавиновых, адениловых и др.). Для животных и других гетеротрофных организмов ПФП -- единственный способ образования пентоз (рибоз и дезоксирибоз) в клетке. Рибозы необходимы для синтеза АТФ, GTP, UTP и других нуклеотидов. Коферменты НАД+, НАДФ+, ФАД, коэнзим А -- тоже нуклеотиды и в их состав входит рибоза.

3.ПФП имеет большое значение как источник образования углеводов с различным числом углеродных атомов в цепи (от С3 до Су). Эритрозо-4-фосфат, возникающий в ПФП, необходим для синтеза шикимовой кислоты -- предшественника многих ароматических соединений, таких, как ароматические аминокислоты, витамины, дубильные и ростовые вещества, лигнин клеточных стенок и др.

4.Компоненты ПФП (рибулозо-1,5-дифосфат, НАДФH) принимают участие в темновой фиксации С02. По существу, ПФП представляет собой обращенный фотосинтетический (восстановительный) цикл Кальвина. Только две из 15 реакций цикла Кальвина специфичны для фотосинтеза, остальные участвуют в окислительном ПФП дыхания и гликолизе.

В хлоропластах окислительный ПФП функционирует в темноте, предотвращая резкое изменение концентрации НАДФH в отсутствие света. Кроме того, триозофосфаты этого цикла в хлоропластах превращаются в 3-ФГК, что важно для поддержания в них уровня АТФ в темноте.

Окисление глюкозы по ПФП осуществляется в результате 12 реакций, тогда как в дихотомический (гликолитический) путь через ПВК и далее через цикл ди- и трикарбоновых кислот включаются более 30 различных реакций.

Не следует, однако, думать, что окисление глюкозо-6-фосфата по схеме, представленной на рис. 5, идет во всех клетках до конца. Очень часто на одном из этапов ПФП переходит в гликолитический. Таким этапом может быть, в частности, транскетолазная реакция (рис. 5, реакция 8), в результате которой ксилулозо-5-фосфат и эритрозо-4-фосфат превращаются во фруктозо-6-фосфат и 3-ФГА -- субстраты, общие для гликолиза и ПФП.

4.3 Глиоксилатный цикл. Механизмы регуляции цикла. Энергетическая эффективность процесса, значение

Этот цикл в 1957 г. был впервые описан у бактерий и плесневых грибов Г. Л. Корнбергом и Г. А. Кребсом. Затем оказалось; что он активно функционирует в про- растающих семенах масличных растений и в других растительных объектах, где запасные жиры превращаются в сахара (глюконеогенез). Глиоксилатный цикл локализован не в митохондриях, как цикл Кребса, а в специализированных микротелах -- глиоксисомах. В клетках животных этот цикл отсутствует.

В глиоксилатном цикле из ЩУК и ацетил-СоА синтезируется лимонная кислота, образуются цис-аконитовая и изолимонная (изоцитрат), как и в цикле Кребса . Затем изолимонная кислота под действием изоцитрат-лиазы распадается на глиоксиловую и янтарную кислоты. Глиоксилат с участием малатсинтазы взаимодействует со второй молекулой ацетил-СоА, в результате чего синтезируется яблочная кислота, которая окисляется до ЩУК.

Рис. 6. Глиоксилатный цикл

Таким образом, в отличие от цикла Кребса в глиоксилатном цикле в каждом обороте участвует не одна, а две молекулы ацетил-СоА и этот активированный ацетил используется не для окисления, а для синтеза янтарной кислоты. Янтарная кислота выходит из глиоксисом, превращается в ЩУК и участвует, в глюконеогенезе (обращенном гликолизе) и других процессах биосинтеза. Глиоксилатный цикл позволяет утилизировать запасные жиры, при распаде которых образуются молекулы ацетил-СоА.

Регуляция ПФП и глиоксилатного цикла. Пентозофосфатный путь окисления регулируется концентрацией НАДФ + , так как содержит две НАДФ-зависимые дегидрогеназы (глюкозо-6- фосфатдегидрогеназу и 6-фосфоглюконатдегидрогеназу). Он регулируется также уровнем синтезов в клетке, потребляющих НАДФH (например, синтезом аминокислот и белков). Их высокий уровень приводит к увеличению содержания окисленного НАДФ + , что стимулирует ПФП.

В регуляции соотношения между ПФП и гликолизом принимает участие ряд интермедиатов: неорганический фосфат, 6-фосфоглюконовая кислота, эритрозо-4-фосфат. Недостаток неорганического фосфата подавляет гликолиз и активирует ПФП. 6-Фосфоглюконовая кислота служит ингибитором гликолитического фермента фосфофруктокиназы (глюкозофосфатизомеразы), что способствует функционированию ПФП. Эритрозо-4-фосфат, являясь субстратом транскетолазной и трансальдолазной реакций, может тормозить активность ферментов гликолиза и тем самым переключать превращения углеводов с гликолитического на пентозофосфатный путь.

Активность глиоксилатного цикла снижается при повышении концентрации оксалоацетата, который ингибирует сукцинатдегидрогеназу ЦТК. Другой ингибитор цикла -- фосфоенолпируват подавляет активность изоцитратлиазы.

5. Цепь переноса водорода и электрона (дыхательная цепь). Комплексы переноса электронов. Окислительное фосфорилирование. Хемиосмотическая теория окисления и фосфорилирования. Механизмы сопряжения процесса транспорта электронов с образованием АТФ

Цикл Кребса, глиоксилатный и пентозофосфатный пути функционируют только в условиях достаточного количества кислорода. В то же время 02 непосредственно не участвует в реакциях этих циклов. Точно так же в перечисленных циклах не синтезируется АТФ (за исключением АТФ, образующегося в цикле Кребса в результате субстратного фосфорилирования на уровне сукцинил-СоА).

Кислород необходим для заключительного этапа дыхательного процесса, связанного с окислением восстановленных коферментов НАДH и ФАДH2 в дыхательной электронтранспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий. С переносом электронов по ЭТЦ сопряжен и синтез АТФ.

Дыхательная ЭТЦ, локализованная во внутренней мембране митохондрий, служит для передачи электронов от восстановленных субстратов на кислород, что сопровождается трансмембранным переносом ионов Н + . Таким образом, ЭТЦ митохондрий (как и тилакоидов) выполняет функцию окислительно-восстановительнои Н -помпы. ,

Б. Чане и др. (США) в 50-х годах, используя значения окислительно-восстановительных потенциалов известных в то время переносчиков е-, спектрофотометрические данные о временной последовательности их восстановления и результаты ингибиторного анализа, расположили компоненты ЭТЦ митохондрий в следующем порядке:

Пара электронов от НАДH или сукцината передается по ЭТЦ до кислорода, который, восстанавливаясь и присоединяя два протона, образует воду.

Д. Грин (1961) пришел к выводу, что все переносчики электронов в митохондриальной мембране сгруппированы в четыре комплексу, что было подтверждёно дальнейшими исследованиями.

Согласно современным данным дыхательная цепь митохондрий включает в себя четыре основных мультиэнзимных комплекса и два небольших по молекулярной массе компонента -- убихинон и цитохром с

Рис.7. Дыхательная электронтранспортная цепь растительных митохондрий

Комплекс I осуществляет перенос электронов от НАДH к убихинону Q. Его субстратом служат молекулы вдутримитохондриального НАДH, восстанавливающиеся в цикле Кребса. Всостав комплекса входит флавиновая ФМН-зависимая НАДH: убихи- нон-оксидоредуктаза, содержащая три железосерных центра (FeSN1-3). При встраивании в искусственную фосфолипидную мембрану этот комплекс функционирует как протонная помпа.

Комплекс II катализирует окисление сукцината убихиноном. Эту функцию осуществляют флавиновая (ФАД-зависимая) сукцинат : убихинон-оксидоредуктаза, в состав которой также входят три железосерных центра (Fes1_3).

Koмплекс III переносит электроны от восстановленного убихинона к цитохрому с, т. е. функционирует как убихинол: цитохром Т-оксидредуктаза. В своем составе он содержит цитохромы b556 и b560, цитохром с, и железосерный белок Риске. По структуре и функции этот комплекс сходен с цитохромным комплексом b6 -- f тилакоидов хлоропластов. В присутствии убихинона комплекс III осуществляет активный трансмембранный перенос протонов.

В терминальном комплексе IV электроны переносятся от цитохрома с к кислороду. _т. е. этот комплекс является цитохромом с: кислород-оксидоредуктазой (цитохромоксидазой). В его состав входят четыре редокс-компонента: цитохромы а и а3 и два атома меди. Цитохром а3 и Сив способны взаимодействовать с 02, на который передаются электроны с цитохрома а -- СиА. Транспорт электронов через комплекс IV сопряжен с активным транспортом ионов Н +.

В последние годы в результате изучения пространственного расположения компонентов ЭТЦ во внутренней мембране митохондрии показано что комплексы I, III и IV пересекают мембрану. На внутренней стороне мембраны, обращенной к матриксу, два электрона и два протона от НАДH поступают на флавинмононуклеотид комплекса I.

Электроны передаются на FeS-центры. Пара электронов от FeS-центров захватывается двумя молекулами окисленного убихинона, которые принимают два иона Н + , образуя семихиноны (2QH) и диффундируя к комплексу III. На эти семихиноны поступает еще пара электронов от цитохрома Ь560 комплекса III, что делает возможной реакцию семихинонов с еще двумя протонами из мАТФикса с образованием 2QH2. Полностью восстановленный убихинон (убихинол) отдает 2е~ цитохрому Ь556 и 2е~ FeSR -- цитохрому с,. В результате освобождаются четыре иона Н+, выходящие в межмембранное пространство митохондрии. Окисленные молекулы убихинона вновь диффундируют к комплексу I и готовы принимать от него (или от комплекса II) новые электроны и протоны. Таким образом, цитохромы Ь служат донорами двух электронов для переноса двух дополнительных протонов через липидную фазу мембраны на каждые два электрона, поступающие из комплекса I.

Водорастворимый цитохром с на наружной стороне мембраны, получив 2е~ от FeSR -- цитохрома ciy передает их на цитохром а -- Сид комплекса IV. Цитохром а3 -- Сив, связывая кислород, переносит на него эти электроны, в результате чего с участием двух протонов образуется вода. Как уже отмечалось, цитохромоксидазный комплекс способен также переносить ионы Н+ через митохондриальную мембрану.

Таким образом, из матрикса митохондрии при транспорте каждой пары электронов от НАДH к 1/2 02 в трех участках ЭТЦ (комплексы I, III, IV) через мембрану наружу переносятся по крайней мере шесть протонов. Как будет показано далее, именно в этих трех участках окислительные процессы в ЭТЦ сопрягаются с синтезом АТФ. Передача 2е~ от сукцината на убихинон в комплексе II не сопровождается трансмембранным переносом протонов. Это приводит к тому, что при использовании сукцината в качестве дыхательного субстрата в ЭТЦ остаются лишь два участка, в которых функционирует протонная помпа.

Рис. 8. Предполагаемое расположение компонентов цепи переноса электронов во внутренней мембране митохондрий в соответствии с хемиосинтетической теорией Митчелла

Особенностью растительных митохондрий (отличающей их от митохондрий животных) является способность окислять экзогенный НАДH, т. е. НАДH, поступающий из цитоплазмы. Это окисление осуществляется по крайней мере двумя флавиновыми НАДH-дегидрогеназами, из которых одна локализована на наружной стороне внутренней мембраны митохондрий, а другая -- в их наружной мембране. Первая из них передает электроны в ЭТЦ митохондрий на убихинон, а вторая -- на цитохром с. Для функционирования НАДH- дегидрогенэзы на наружной стороне внутренней мембраны необходимо присутствие кальция.

Другое существенное отличие растительных митохондрий состоит в том, что во внутренней мембране помимо основного (цитохромного) пути переноса электронов имеется альтернативный путь переноса е~, устойчивый к действию цианида.

Перенос электронов от НАДH к молекулярному кислороду через ЭТЦ митохондрий сопровождается потерей свободной энергии. Какова судьба этой энергии? Еще в 1931 г. В. А. Энгельгардт показал, что при аэробном дыхании накапливается АТФ. Он первый высказал идею о сопряжении между фосфорилированием АДФ и аэробным дыханием. В 1937--1939 гг. биохимики В. А. Белицер в СССР и Г. Калькар в США установили, что при окислении промежуточных продуктов цикла Кребса, в частности янтарной и лимонной кислот, суспензиями животных тканей исчезает неорганический фосфат и образуется АТФ. В анаэробных условиях или при подавлении дыхания цианидом такого фосфорилирования не происходит. Процесс фосфорилирования АДФ с образованием АТФ, сопряженный с переносом электронов по ЭТЦ митохондрий, получил название окислительного фосфорилирования.

По поводу механизма окислительного фосфорилирования существуют три теории: химическая, механохимическая (конформационная) и хемиосмотическая.

Химическая и механохимическая гипотезы сопряжения. Согласно химической гипотезе в митохондриях имеются интермедиаторы белковой природы (X, Y, Z), образующие комплексы с соответствующими восстановленными переносчиками. В результате окисления переносчика в комплексе возникает высокоэнергетическая связь. При распаде комплекса к интермедиатору с высокоэнергетической связью присоединяется неорганический фосфат, который затем передается на АДФ:

Однако несмотря на упорные поиски, не удалось выделить или как-то иначе доказать реальное существование постулированных высокоэнергетических интермедиаторов типа X ~ P. Гипотеза химического сопряжения не объясняет, почему окислительное фосфорилирование обнаруживается только в препаратах митохондрий с ненарушенными мембранами. И, наконец, с позиций этой гипотезы не находит объяснения способность митохондрий подкислять внешнюю среду и изменять свой объем в зависимости от степени их энергизации.

Способность митохондриальных мембран к конформационным изменениям и связь этих изменений со степенью энергизации митохондрий послужила основой для создания механохимических гипотез образования АТФ в ходе окислительного фосфорилирования. Согласно этим гипотезам энергия, высвобождающаяся в процессе переноса электронов, непосредственно используется для перевода белков внутренней мембраны митохондрий в новое, богатое энергией конформационное состояние, приводящее к образованию АТФ. Одна из гипотез подобного рода, выдвинутая американским биохимиком П. Д. Бойером (1965), может быть представлена в виде следующей схемы:



Автор предположил, что запасание энергии происходит путем конформационных изменений ферментов ЭТЦ аналогично тому, как это наблюдается в белках мышц. Актомиозиновый комплекс сокращается, гидролизуя АТФ. Если сокращение белкового комплекса достигается за счет другой формы энергии (за счет окисления), то расслабление, возможно, будет сопровождаться синтезом АТФ.

Таким образом, согласно механохимическим гипотезам, энергия окисления превращается сначала в механическую энергию, а затем в энергию высокоэнергетической связи АТФ. Однако, подобно химической теории сопряжения, механохимические гипотезы также не могут объяснить подкисление митохондриями окружающей среды.

Хемиосмотическая теория сопряжения. В настоящее время наибольшим признанием пользуется хемиосмотическая теория английского биохимика П. Митчелла (1961). Он высказал предположение, что поток электронов через систему молекул-переносчиков сопровождается транспортом ионов Н+ через внутреннюю мембрану митохондрий. В результате на мембране создается электрохимический потенциал ионов Н + , включающий химический, или осмотический, градиент и электрический градиент (мембранный потенциал). Согласно хемиосмотической теории электрохимический трансмембранный потенциал ионов Н+ и является источником энергии для синтеза АТФ за счет обращения транспорта ионов Н+ через протонный канал мембранной Н + -АТФазы.

Теория Митчелла исходит из того, что переносчики перешнуровывают мембрану, чередуясь таким образом, что в од сторону возможен перенос и электронов, и протонов, а в об ратную -- только электронов. В результате ионы Н+ накапливаются на одной стороне мембраны.

Между двумя сторонами внутренней митохондриальной мембраны в результате направленного движения протонов против концентрационного градиента возникает электрохимический потенциала Энергия, запасенная таким образом, используется для синтеза АТФ как результат разрядки мембраны при обратном (по концентрационному градиенту) транспорте протонов через АТФазу, которая работает в этом случае как АТФ-синтетаза.

За прошедший период хемиосмотическая гипотеза Митчелла получила целый ряд экспериментальных подтверждений. Одним из доказательств роли протонного градиента в образовании АТФ при окислительном фосфорилировании может служить разобщающее действие на этот процесс некоторых веществ. Известно, что 2,4-динитрофенол (2,4-ДНФ) подавляет синтез АТФ, но стимулирует транспорт электронов (поглощение 02), т. е. разобщает дыхание (окисление) и фосфорилирование. Митчелл предположил, что такое действие 2,4-ДНФ связано с тем, что он переносит протоны через мембрану (т. е. является протонофором) и поэтому разряжает ее. Это предположение полностью подтвердилось. Оказалось, что разные по своей химической природе вещества, разобщающие окисление и фосфорилирование, сходны в том, что, во-первых, они растворимы в липидной фазе мембраны, а, во-вторых, это слабые кислоты, т. е. легко приобретают и теряют протон в зависимости от рН среды. В. П. Скулачев на искусственных фосфолипидных мембранах показал, что чем легче вещество переносит протоны через мембрану, тем сильнее разобщает эти процессы. Другое экспериментальное подтверждение роли протонного градиента в фосфорилировании было получено Митчеллом, который сообщил о синтезе АТФ в митохондриях в результате замены щелочной инкубационной среды на кислую (т. е. в условиях искусственно созданного трансмембранного градиента ионов Н+).

В 1973 г. Э. Рэкеру (США) удалось получить липосомы (везикулы из фосфолипидов), в которые была встроена АТФаза, выделенная из митохондрий сердца быка, и хромопротеин галофильной бактерии Halobacterium halobium -- бактериородопсин, обусловливающий создание протонного градиента за счет энергии света. Фосфолипиды для реконструкции мембран этих липосом были выделены из растений (соевые бобы). Полученные таким образом гибридные пузырьки на свету осуществляли фосфорилирование.

6.АТФ как основная энергетическая валюта клетки, её структура и функции. Механизмы синтеза АТФ

Процессы обмена вещества включают в себя реакции, идущие с потреблением энергии, и реакции с выделением энергии. В некоторых случаях эти реакции сопряжены. Однако часто реакции, в которых энергия выделяется, отделены в пространстве и во времени от реакций, в которых она потребляется. В процессе эволюции у растительных и животных организмов выработалась возможность хранения энергии в форме соединений, обладающих богатыми энергией-связями. Среди них центральное место занимает аденозинтрифосфат (АТФ). АТФ представляет собой нуклеотидфосфат, состоящий из азотистого основания (аденина), пентозы (рибозы) и трех молекул фосфорной кислоты. Две концевые молекулы фосфорной кислоты образуют макроэргические, богатые энергией связи. В клетке АТФ содержится главным образом в виде комплекса с ионами магния. Аденозинтрифосфат в процессе дыхания образуется из аденозиндифосфата и остатка неорганической фосфорной кислоты (Фн) с использованием энергии, освобождающейся при окислении различных органических веществ:

Страницы: 1, 2, 3, 4