Биогенез мембран

p align="left">Внутренняя мембрана

По-видимому, сигнал сортировки у многих белков внутренней мембраны, импортируемых из цитоплазмы, может быть заменен соответствующей гидрофобной последовательностью, выполняющей функции стоп-сигнала переноса. Об этом свидетельствует, в частности, локализация гибридного белка, полученного путем присоединения к карбоксильной части G-белка везикулярного стоматита сигнальной последовательности, определяющей транспорт в матрикс. Гибридный белок импортировался в митохондрию in vitro и закреплялся во внутренней мембране с помощью трансмембранного домена G-белка. Сегмент N-концевой последовательности, функционирующий как стоп-сигнал переноса во внутреннюю, но не в наружную мембрану, содержится также в ADP/ATP-переносчике.

Сигнальные последовательности в хлоропластах

Первичные сигналы сортировки хлоропластных белков, закоди-ванных в ядре, сходны с сигналами, характерными для митохондри-альных белков. Так, было показано, что препоследовательность одного из хлоропластных белков направляет белки-пассажиры в митохондрию дрожжей. Каков механизм сортировки белков по разным органеллам при наличии как хлоропла-стов, так и митохондрий -- неясно. Сортировка белков хлоропла-стов в самой органелле является даже более сложной проблемой, чем в случае митохондрий. Хлоропластные белки могут находиться в любой из двух мембран оболочки или в строме, они могут встраиваться в мембрану тилакоида или пересекать ее, проникая в полость тилакоида. Вторичные сигналы, по-видимому, локализованы внутри N-концеЕой препоследовательности в группах из отдельных доменов аналогично митохондриальным сигналам сортировки. Таким образом, для того чтобы белки, закодированные в ядре, могли попасть в полость тилакоида, необходимы по крайней мере два сигнала: один для прохождения белка через оболочку с последующим образованием растворимого предшественника в строме и второй для транспорта через мембрану тилакоида.

Структурные особенности последовательностей, ответственных за направление белков в матрикс

При сравнении сигнальных последовательностей, ответственных за транспорт белков в митохондрии, выявляется не какая-то специфическая последовательность, а скорее общая тенденция этих сигналов к образованию положительно заряженных амфифильных спиралей. Как правило, эти последовательности вообще не несут отрицательных зарядов или слабо заряжены, причем лизиновые н аргининовые остатки расположены таким образом, что при формировании а-спирали они оказываются в основном на одной из ее сторон, образуя область с четко выраженными гидрофобными свойствами. Такие амфифильные последовательности очень часто встречаются в растворимых белках. Показано, что внутренние последовательности из цитозольного фермента дигидрофолат-редуктазы, а также последовательности, образованные случайным образом из генома Е. coli, будучи присоединенными к белку-пассажиру, инициируют транспорт этого белка в митохондрию. Роль таких сигналов могут играть многие искусственные последовательности. Интересно отметить сходство между сигналом, ответственным за транспорт белка в митохондрию, и предполагаемой амфифильной спиралью, которая, по-видимому, образует «датчик напряжения» в ионных каналах. Очевидно, что для узнавания рецепторов, участвующих в импорте в митохондрию, существенны скорее некоторые особенности вторичной структуры, чем наличие характерных аминокислотных остатков. Как мы уже говорили, хорошую модель рецептора, способного связывать множество разнообразных пептидов, представляет антиген гистосовместимости HLA-A2.

Показано, что синтезированные химическим способом пептиды, соответствующие митохондриальным сигнальным последовательностям, связываются с липидными би- и монослоями и образуют спираль в присутствии некоторых фосфолипидов и детергентов. Кроме того, один из синтезированных пептидов блокирует импорт предшественников митохондриальных белков, возможно связываясь со специфическими рецепторами. Полагают, что сигнальная последовательность сначала вызывает концентрирование предшественника в мембранах, а затем связывание со специфическим рецептором в наружной мембране. Как видно из рис. 8, необходимым условием связывания является наличие трансмембранного потенциала на внутренней мембране. Исходя из предложенной модели амфнфильный сигнальный пептид сначала связывается с поверхностью мембраны, а затем продвигается внутрь ее под действием разности потенциалов. Такая промежуточная структура положительно заряженной спирали, погруженной в мембрану, конечно, нестабильна. Однако, если энергетический барьер перехода в это состояние меньше, чем примерно 18 ккал/моль, то пептид все же может пересекать мембрану с приемлемой скоростью. Впрочем, это маловероятно, особенно если учесть высокую плотность гидроксилированных аминокислот, обычно присутствующих в препоследовательностях помимо других положительно заряженных аминокислот. Согласно альтернативной модели, трансмембранный потенциал влияет на рецепторные белки или предполагаемый канал внутри мембраны, через который осуществляется перенос. Отметим, что для переноса в строму хлоропласта не требуется наличия трансмембранного потенциала, хотя сигналы, ответственные за транспорт белков в эти органеллы, сходны.

6. СИГНАЛЬНЫЕ ПЕПТИДАЗЫ

Для удаления временных N-концевых сигнальных пептидов необходимы специфические белки. Наиболее полно охарактеризованы сигнальные протеазы из Е. coli. Большинство экспортируемых белков Е. coli содержат сигнальный пептид, который отщепляется на периплазматической поверхности внутренней мембраны с помощью лидер-пептидазы; ее структура представлена на рис. 10.12. Для переноса белков через внутреннюю мембрану эта пептидаза не нужна, но она необходима для высвобождения экспортируемого белка из цитоплазматической мембраны. In vitro очищенный фермент мог функционировать, будучи включенным в липосомы. Специфичность расщепления весьма высока, но не определяется исключительно аминокислотной последовательностью вблизи сайта расщепления. Сигнальная пептидаза, функционирующая в эидоплазматическом ретикулуме, имеет ту же специфичность, что и соответствующий фермент Е. coli, что неудивительно, если учесть сходство сигнальных последовательностей. Была очищена сигнальная пептидаза из микросом эукариот. Показано, что она ассоциирована с другими полипептидами, возможно имеющими отношение к механизму переноса.

У Е. coli имеется вторая сигнальная пептидаза, участвующая в процессинге пролипопротеинов. Эти полипептидные компоненты оболочки Е. coli замечательны тем, что при созревании их N-конец модифицируется с помощью глицерида. Пролипопротеи-новая сигнальная пептидаза также находится в цитоплазматической мембране. После отщепления сигнальный пептид остается в цитоплазматической мембране и разрушается с помощью мембра-носвязанного фермента протеазы IV.

В митохондриях и хлоропластах должно присутствовать несколько сигнальных пептидаз, поскольку процессинг происходит более чем в одном компартменте. Растворимую пептидазу из митохондриального матрикса удалось частично очистить, но охарактеризована она не полностью.

7. РАСТВОРИМЫЕ И МЕМБРАНОСВЯЗАННЫЕ БЕЛКИ, НЕОБХОДИМЫЕ ДЛЯ ПЕРЕНОСА

Идентифицировано несколько цитозольных и мембраносвязан-ных белковых компонентов, необходимых для переноса. Наиболее детально охарактеризованы белковые факторы, участвующие во встраивании белков в эндоплазматический ретикулум млекопитающих.

1. Сигнал-распознающая частица. Это растворимый рн-бонуклеопротеиновый комплекс, состоящий из шести разных белков и молекулы 7S-PHK. СРЧ необходима для инициации переноса. Она связывается с сигнальной последовательностью образующегося полипептида во время его синтеза на рибосоме. Для препролактина, например, константа диссоциации составляет 1 нМ. С помощью метода фотохимического сшивания был идентифицирован один из полнпептидов, непосредственно взаимодействующий с сигнальной последовательностью предшественника. По некоторым данным, полученным для бесклеточных систем, связывание СРЧ ингибирует трансляцию или вызывает ее задержку. Впрочем, не исключено, что этот феномен является артефактом; во всяком случае, как было показано на модельных опытах, его не обязательно привлекать для объяснения кинетики переноса белков in vivo. Одна из вероятных функций СРЧ состоит в предотвращении неправильного свертывания образующегося полипептида, которое может блокировать перенос. Задержка трансляции должна уменьшать вероятность такого ошибочного свертывания и, следовательно, увеличивать эффективность переноса белков.

Некоторые небольшие белки транспортируются в эн-доплазматический ретикулум независимо от СРЧ. В их число входят препропептид GLa лягушки, препромелиттин и пробелок оболочки фага М13. Во всех этих примерах конформация предшественника такова, что белки должны оставаться способными к переносу даже в отсутствие СРЧ и рибосом.

2. Рецептор СРЧ, или стыковочный белок. Комплекс СРЧ/ рибосома/образующаяся полипептидная цепь транспортируется в шероховатый эндоплазматический ретикулум, преодолевая энергию сильного взаимодействия между СРЧ и мембраносвязанным рецептором СРЧ, называемым также стыковочным белком. Рецептор СРЧ содержит субъединицу с мол. массой 73 кДа, присоединенную N-концом к мембране. Вероятно, рибосома также связывается со специфическими рецепторами, присутствующими в мембране.

3. Рецептор сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность на образующейся полипептидной цепи перемещается от СРЧ ко второму рецептору, находящемуся в мембране и называемому рецептором сигнальной последовательности. Об этом свидетельствуют результаты опытов по фотохимическому сшиванию, в которых используется метка, связанная с сигнальной последовательностью препролактина. Предполагаемый мембраносвязанный рецептор представляет собой гликопротеин с мол. массой 35 кДа. Возможно, он образует часть канала, через который осуществляется перенос. С помощью такого же подхода с использованием поперечной сшивки и синтетического сигнального пептида был обнаружен еще один кандидат на роль рецептора сигнальной последовательности. Связь между этими двумя белками неизвестна и функции их до конца не установлены. Как только образовавшаяся полипептидная цепь связывается с мем-браносвязанным рецептором, СРЧ и ее рецептор могут освободиться от рибосомы и принять участие в новом цикле. О предполагаемом канале, участвующем в переносе, ничего не известно; очистка его является довольно сложной задачей.

Было показано, что для переноса белков через эндоплазматический ретикулум дрожжей необходимы растворимые факторы, однако их сходство с СРЧ не установлено. Перенос различных секретируемых белков в дрожжах может происходить после завершения трансляции, поэтому не исключается, что в этих случаях образующиеся полипептидные цепи взаимодействуют с мембрано-связанным рецептором сигнальной последовательности. По-видимому, растворимые белковые факторы необходимы и для экспорта белков в Е. coli, а также для импорта белков в митохондрию, но охарактеризовать их не удалось. Было показано, что продукт гена secY, необходимый для экспорта белков в Е. coli, является мембраносвязанным, но его функция остается неизвестной.

Определенные успехи были достигнуты при идентификации рецептора на наружной митохондриальной мембране, необходимого для импорта белков. Опыты по связыванию с порином показали, что на мембране имеется некий рецептор с высоким сродством, который участвует в импорте ADP/ATP-переносчика, белка внутренней мембраны. Идентифицированы два разных полипептида -- компонента рецептора сигнальной последовательности наружной мембраны. При этом использовались два метода: блокирование импорта белков ан-тителами и химическое сшивание с синтетическим сигнальным пептидом. Интересно, что импорт в митохондрии, по-видимому, не связан с наружной мембраной, которая удаляется при образовании митопластов. Это наблюдение позволяет предполо-

жить, что другой рецептор сигнальной последовательности находится во внутренней мембране.

8. СБОРКА МУЛЬТИСУБЪЕДИНИЧНЫХ КОМПЛЕКСОВ И ОБНОВЛЕНИЕ МЕМБРАННЫЗ БЕЛКОВ

После встраивания мембранного полипептида в мембрану он еще должен приобрести правильную конформацию, обеспечивающую его биологическую активность, а если речь идет о мультнсубъ-единичных комплексах, то связаться с другими белками. В частности, у эукариот при этом должны произойти различные ковалент-ные модификации, например гликозилирование, ацилирование, сульфирование или образование днсульфидных связей. Даже когда такие модификации не являются необходимыми, процесс конформацион-ного созревания может быть медленным и отстоять по времени от встраивания в мембрану.

Например, у Е. coli четко наблюдается сборка стабильных три-меров обоих белков, LamB и OmpF, после включения соответствующих мономеров в наружную мембрану, при этом созревание LamB занимает около 5 мин. В эукариотнческих клетках гли-копротеин гемагглютннииа вируса гриппа, прежде чем попасть из эндоплазматического ретикулума в комплекс Гольджи, должен сформировать правильную четвертичную структуру, соответствующую зрелой форме. Несвериутые молекулы гемагглютинина остаются в эндоплазматическом ретикулуме. Образование тримеров занимает примерно 7--10 мии. Сходная олигомеризация наблюдается также для G-белка вируса везикулярного стоматита.

Сборка многих мультисубъединичных комплексов, содержащих разные субъединицы, тоже, по-видимому, происходит в эндоплазматическом ретикулуме. Примером служит никотиновый ацетилхо-линовый рецептор, который содержит две а-субъединицы и по одной /3-, у- и б-субъединице. С помощью антител можно различить отдельные формы а-субъединицы: 1) начальный продукт, встраивающийся в эндоплазматический ретикулум; эта форма не может связывать антагонист а-бунгаротоксин; 2) форма, способная связываться с а-бунгаротоксином и образующаяся через несколько минут после завершения трансляции в эндоплазматическом ретикулуме; 3) зрелый рецептор, содержащий все субъединицы, который обнаруживается через 15 мин после завершения трансляции в эндоплазматическом ретикулуме; 4) готовый рецептор на клеточной поверхности, появляющийся спустя примерно 2 ч после трансляции. Созревание включает образование днсульфидных связей, олигосахаридный процессинг и ацилирование при участии жирных кислот. Вероятно, определенную роль в сборке, происходящей в комплексе Гольджи, играет фосфорилирование субъединиц.

Решающим фактором процесса сборки является, вероятно, стабильность таких стехиометрических комплексов, как ацетилхолино-вый рецептор. По-видимому, в некоторых системах отдельные субъединицы синтезируются в значительном избытке и не образуют стабильных комплексов, а подвергаются протеолитическому расщеплению. Об этом свидетельствуют результаты, полученные при изучении некоторых мультисубъедииичных комплексов, в частности Т-клеточного рецептора антигена.

Изучался также процесс созревания и сборки структуры, образующей Na-канал. Необходимым условием созревания является образование дисульфидной связи между а- и /Зг-субъединицами, однако это событие происходит спустя примерно 1 ч после трансляции и транспорта субъединиц в аппарат Гольджи, а рецептор появляется на клеточной поверхности чере:> 4 ч после трансляции. В этом случае свободные а-субъединнцы не подвергаются быстрой деградации, а сохраняются в межклеточном пуле и, возможно, используются в дальнейшем в качестве предшественников для формирования канала в растущих нейронах.

Созревшие мембранные белки подвергаются непрерывному обновлению. Период полуобновления Na-канала составляет около 30 ч, что типично для поверхностных белков. Обновление большой субъединицы Na/K-АТРазы в растущих клетках в культуре происходит за время 20 -- 40 ч. По-видимому, деградация по крайней мере некоторых белков происходит в лизосомах. В качестве примера можно привести цитохром Р450, содержащийся в эндоплазматическом ретикулуме.

Два интересных примера обновления мембранных белков

Стабильность белков в клетке определяется множеством различных факторов. Особенно интересным примером деградации мембранных белков является гидроксиметилглутарил-СоА-редуктаза. Этот фермент находится в гладком эндоплазматическом ретикулуме и регулирует эндогенный синтез холестеро-ла. Деградация его происходит довольно быстро и ускоряется при взаимодействии с холестеролом. Для ускорения процесса необходимо наличие мембраносвязанного домена фермента. При определенных условиях в культуре ооцитов китайского хомячка наблюдается сверхпродукция этого фермента. В результате образуются мембранные трубочки, занимающие 15% клеточного объема и содержащие другие мембранные белки, а также липиды. Добавление холестерола приводит к быстрой деградации избытка мембран, что говорит о координации синтеза и деградации мембранных компонентов.

Другим интересным примером селективного метаболизма мембранных белков является гербицидсвязывающий белок с мол. массой 32 кДа из тилакоидов хлоропластов. Этот белок синтезируется как предшественник, созревая внутри отдельных ламелл тилнкоида, не собранных в граны, и является частью фотосистемы II в ламеллах, входящих в граны. На свету скорость деградации этого полипептида в мембране намного выше, чем других белков. Причина этого явления неизвестна; возможно, оно связано с тем, что в фотосистеме II на свету происходят какие-то повреждения.

9.