Аппарат экспрессии генов и его логика

p align="left">Как узнается первый кодон? Связывание 30S-6-частицы с мРНК находится под строгим контролем нуклеотидной последовательности, расположенной примерно за 10 нуклеотидов до 5'-конца инициаторного кодона. Взаимодействию способствует комплементарное спаривание этой богатой пуринами последовательности из пяти-восьми нуклеотидов, называемой последовательностью Шайна-Дальгарно, с полипиримидиновым участком, находящимся вблизи 3'-конца 16S-pPHK. Эффективность инициации существенно зависит от степени комплементарности между последовательностями Шайна-Дальгарно и 16S-pPHK и от расстояния пурин-богатого участка до кодона AUG. Эта особенность наряду с другими, о которых будет сказано позднее, и объясняет различия в эффективности трансляции различных мРНК.

Процесс инициации зависит также от вторичной структуры того участка молекулы мРНК, в котором находится инициаторный кодон AUG. Если этот кодон окажется внутри двухцепочечного участка, то инициация будет неэффективна или вовсе блокируется. Именно таким образом может регулироваться доступность инициаторного AUG-кодона для 30S-рибосомы. AUG становится недоступным, если он оказывается спаренным при образовании конденсированной формы зрелой мРНК, и, напротив, доступным для инициации во время транскрипции мРНК или во время трансляции других кодирующих последовательностей на той же молекуле мРНК.

б. Элонгация полипептидной цепи

При ассоциации двух рибосомных субчастиц перед инициацией трансляции образуются два функциональных участка, необходимых для сборки белка: Р- и А-участки. Fmet-TPHKj» занимает Р-участок, а для образования первой пептидной связи необходимо, чтобы аминоацил-тРНК, соответствующая следующему кодону, заняла А-участок. Для этого аминоацил-тРНК должна сначала связать EF-Tu и GTP. Образовавшийся тройной комплекс и доставляет аминоацил-тРНК к А-участку. GTP в это время гидролизуется, и комплекс отделяется от рибосомы. Когда оба участка, А и Р, заняты, пептидилтрансферазная активность 50S-субчастицы катализирует перенос группы Fmet с ее тРНК на аминогруппу аминоацил-тРНК, находящейся в А-участке. В результате в А-участке оказывается дипептидил-тРНК, а в Р - свободная тРНК.

Для прочтения следующего кодона и удлинения полипептидной цепи еще на одну аминокислоту вся серия реакций должна повториться. Однако, прежде чем это произойдет, тРНК должна освободить Р-участок, образовавшаяся дипептидил-тРНК должна переместиться на него, а новый кодон должен быть готов к тому, чтобы занять освободившийся А-участок. Все эти процессы осуществляются с помощью EF-G при GTP-зависимой транслокации рибосомы. Источником энергии для перемещения рибосомы к следующему триплету кодирующей последовательности и удаления свободной тРНК из Р-сайта служит реакция гидролиза GTP до GDP. Теперь новый кодон, занявший А-сайт, готов к спариванию с родственной аминоацил-тРНК.

Сразу после связывания аминоацил-тРНК с А-участком высвобождается комплекс EF-Tu-GDP и происходит регенерация функционально активного EF-Tu-GTP. При этом EF-Tu-GDP взаимодействует с белком EF-Ts, что приводит к отделению GDP и образованию комплекса EF-Tu «EF-Ts. Далее EF-Tu «EF-Ts взаимодействует с GTP, происходит регенерация EF-Tu-GTP и отделение EF-Ts, и оба соединения оказываются готовыми к следующему циклу.

Необходимо отметить несколько особенностей процесса элонгации. 1. При образовании каждой пептидной связи расходуется энергия, равная четырем энергетическим эквивалентам: два эквивалента АТР потребляются при аминоацилировании тРНК и два эквивалента GTP-в каждом цикле элонгации. 2. При инициации трансляции IF-2 узнает Fmet-тРНКFMet среди всех других аминоацил-тРНК, a EF-Tu отличает тРНК,» от Fmet-тРНКMMet при внедрении в А-участок. 3. Факторы элонгации EF-Tu и EF-G то присоединяются, то отделяются от рибосомы в зависимости от того, связаны ли они с GTP или с GDP соответственно. 4. Растущая полипептидная цепь всегда соединена своим карбоксильным концом с тРНК, которая соответствует С-концевой аминокислоте в растущей полипептидной цепи. 5. Пептидилтрансфераза катализирует формирование пептидных связей между карбоксильным концом растущей цепи и аминогруппой аминоацил-тРНК.

в. Терминация элонгации полипептидной цепи

Процесс последовательной трансляции кодонов в конце концов доходит до того момента, когда в А-участке оказывается один из трех терминирующих кодонов - UAG, UAA или UGA. Из-за отсутствия тРНК, отвечающих этим кодонам, полипептидил-тРНК остается связанной с Р-участ-ком. Здесь вступают в действие специфические факторы RF-1 и RF-2, которые катализируют отсоединение полипептидной цепи от тРНК, отделение их обоих от рибосомы, а 70S-рибосомы - от мРНК. RF-1 узнает в А-участке кодон UAA или UAG; RF-2 включается в том случае, когда в А-участке оказывается UAA или UGA; RF-3 облегчает работу двух других факторов. Если терминирующим кодоном является UAA, то эффективность процесса терминации оказывается наибольшей, поскольку этот кодон узнают оба фактора - RF-1 и RF-2. Однако, каким бы из стоп-кодонов ни обеспечивалась терминация, ее эффективность зависит от фланкирующих эти кодоны последовательностей в мРНК. Хотя общие черты и даже некоторые детали процесса терминации известны, точный его механизм и каталитическая роль факторов RF-1 и RF-2 пока неясны.

7. Некоторые общие особенности процесса трансляции

В предыдущем разделе мы подробно рассмотрели события одного цикла трансляции мРНК на рибосоме. Здесь акцент будет сделан на некоторых общих принципах процесса в целом и на нарушении или блокировании его отдельных стадий.

а. Одновременная трансляция молекулы мРНК более чем одной рибосомой

После инициации трансляции 70S-рибосома перемещается от сайта инициации по мере считывания каждого последующего кодона. Когда расстояние от рибосомы до сайта инициации достигнет величины 100-200 нуклеотидов, в этом сайте может произойти новая инициация. Более того, как только вторая рибосома пройдет такое же расстояние, может произойти третья инициация, и т.д. Итак, одну и ту же белок-кодирующую последовательность мРНК могут одновременно транслировать несколько рибосом. Подобные мультирибосомные трансляционные комплексы называются полирибосомами или полисомами. Каждая рибосома полисомы обязательно целиком транслирует кодирующую последовательность с образованием полноразмерного полипептида. От каждой рибосомы в полисоме отходит полипептид, длина которого соответствует расстоянию, пройденному рибосомой от сайта инициации. Эта длина пропорционально увеличивается по мере продвижения рибосомы по мРНК, начиная с 5'-конца кодирующей последовательности.

б. Трансляция бактериальных мРНК может осуществляться параллельно транскрипции

Образование мРНК при транскрипции гена или кластера генов начинается с 5'-конца в направлении к 3'-концу. Следовательно, формирование комплекса инициации трансляции может произойти сразу же после того, как будет транскрибирована последовательность, в пределах которой находится инициирующий кодон. И в самом деле, синтез полипептидной цепи обычно начинается до завершения транскрипции 3'-концевой части мРНК.

Если бактериальная транскрипционная единица содержит более одной кодирующей белок последовательности, как, например, в случае trp- или lac-оперонов, то на рибосомах может начаться и даже завершиться трансляция первой из этих кодирующих последовательностей еще до окончания транскрипции остальных. Матричные РНК, состоящие из многих белок-кодирующих участков, часто транслируются последовательно, т.е. инициация, элонгация и терминация трансляции первой кодирующей последовательности сопровождаются такими же событиями на втором, третьем и последующих кодирующих сегментах. После того как рибосомы доходят до сигнала терминации в первой или любой другой кодирующей последовательности, они отделяются от мРНК, и со следующим инициаторным участком связывается новый комплекс. Однако в некоторых случаях рибосомы не отделяются от мРНК, а перемещаются вдоль молекулы, образуя новые комплексы инициации в других сайтах.

в. Рибосомы начинают новый раунд после трансляции кодирующей последовательности

Как мы уже говорили, когда осуществляющая трансляцию 70S-рибосома доходит до терминирующего кодона, полноразмерная полипептидная цепь отделяется от мРНК, а обе они - полипептид и тРНК - отделяются от рибосомы, и происходит разделение 70S-рибосомы и мРНК. 70S-рибосомы не способны к инициации новых раундов синтеза полипептидов и, следовательно, должны диссоциировать на составляющие их 50S- и 30S-субчастицы. Такая диссоциация контролируется фактором инициации IF-3 совместно с IF-1. «Рибосомный» цикл завершается ассоциацией 50S-субчастицы с 30S-субчастицей, связанной с мРНК и несущей IF-2, Fmet-тРНКFMet и GTP, с образованием функционального трансляционного 70S-аппарата. Таким образом, изменяя количество 30S- и 50S-субчастиц по отношению к их предшественнику - 70S-рибосоме, - фактор IF-3 осуществляет общий контроль уровня белкового синтеза.

Затем проделывает третья рибосома и т.д. В результате на одной и той же мРНК могут одновременно синтезироваться сразу несколько полипептидов.

г. Взаимодействие кодона и антикодона

Большинство молекул тРНК спаривается более чем с одним кодоном. Поскольку кодоны транслируются при участии антикодонов разных тРНК, можно было бы ожидать, что для каждого из 61 кодона, детерминирующего аминокислоты, имеется своя тРНК. Однако не существует ни разных тРНК для каждого из четырех валиновых или глициновых кодонов, ни разных тРНК для обоих тирозиновых или обоих лизиновых кодонов. Действительно, эксперименты in vitro и in vivo показали, что некоторые тРНК могут транслировать более чем один кодон. Так, кодоны UAU и UAC транслирует единственная тРНКТуг. Поскольку антикодон этой тРНКТуг имеет последовательность 5'-GUA-3', он может образовать комплементарные пары с первыми двумя основаниями любого из этих кодонов. Соответственно G способен спариваться как с U, так и с С, находящимися в третьем положении кодонов; аналогичным образом U, находясь на 5'-конце какого-либо антикодона, может спариться и с А, и с G, находящимися на 3'-конце соответствующих кодонов. На самом деле трансляция всех пар кодонов, у которых в третьей позиции стоит U или С, может осуществляться одной и той же тРНК, у которой первым основанием в антикодоне оказывается G или какое-то модифицированное основание. По-видимому, при спаривании кодонов и антикодонов в А- и Р-участках включаются какие-то стабилизирующие взаимодействия, отличные от тех, которые имеют место при обычном комплементарном спаривании оснований.

Анализ генетического кода показывает, однако, что существуют специфические взаимодействия, позволяющие различать кодоны, у которых в третьей позиции стоит А или G. Например, тРНК, расшифровывающая кодон AUG как метионин, должна отличать этот триплет от кодона AUA, обозначающего изолейцин, а тРНК'1*11' должна отличать триптофановый кодон UGG от терминирующего кодона UGA. Специфичность обеих этих операций декодирования определяется спариванием С антикодона с G, находящимся в третьем положении кодона.

Модификация оснований в антикодонах может еще сильнее ограничить диапазон возможных взаимодействий кодон-антикодон. Например, гипоксантин, занимая место аденина в той позиции антикодона, по которой происходит спаривание с третьим основанием кодона, может обусловить спаривание такого антикодона с кодонами, у которых в последней позиции стоят основания U, С или А. Разнообразие модификаций оснований в антикодо-нах или-что встречается наиболее часто - оснований, соседствующих с антикодоном, изменяет специфичность взаимодействия аминоацил-тРНК-кодон. Таким способом обычно предотвращаются ошибки при считывании третьего основания кодонов и обеспечивается надежность процесса декодирования.

Правила спаривания оснований, согласно которым молекулы тРНК одного типа могут узнавать несколько разных кодонов, называются правилами неоднозначного соответствия. Следует отметить, однако, что термин «качание», используемый для описания некоторой свободы спаривания третьего основания кодона, просто как бы затушевывает тот факт, что мы до конца не знаем, какие именно химические и структурные особенности обусловливают кодон-антикодоновые взаимодействия в Р-и А-участках рибосомы.

Мутации в кодонах и антикодонах. Мутации, затрагивающие различные компоненты трансляционного аппарата, могут изменить результат считывания кодирующей последовательности. Наиболее драматичные последствия вызывают те мутации в гене, кодирующем белок, которые превращают кодон, отвечающий какой-то аминокислоте, в терминирующий кодон и тем самым приводят к преждевременному завершению синтеза из-за досрочной терминации трансляции в мутировавшем сайте. Примером может служить превращение лизинового кодона ААА в UAA и глутаминового кодона CAG в UAG. Аналогично любая мутация, в результате которой происходит замена аминокислотного кодона на кодон UGA, тоже вызовет преждевременную остановку синтеза полипептидной цепи. Однако, если в результате второй мутации произойдет изменение соответствующего основания в антикодоне тРНК, терминация может быть предотвращена, или супрессирована, и образуется полноразмерный, хотя и измененный, белок. Например, если тРНК, тРНК или тРНК изменятся подобным образом, то они смогут прочитать кодон UAG как аминокислотный. С помощью различных механизмов может произойти ошибочная трансляция и таких мутантных кодонов, как UAA и UGA. Мутации в тРНК-генах, затрагивающие основания, отличные от тех, которые составляют антикодон, могут привести к изменению специфичности или стабильности взаимодействий кодона и антикодона. Благодаря таким механизмам может быть предотвращена преждевременная терминация синтеза полипептида, если терминирующий кодон будет прочитан как смысловой. Подобная супрессия терминации, как правило, не очень эффективна, поэтому наряду с полноразмерными образуются и укороченные, преждевременно терминированные полипептидные цепи. Благодаря относительной неэффективности такой трансляционной супрессии не приносит большого вреда и случайное проскакивание терминирующих кодонов, находящихся на естественных концах кодирующих мРНК.

Миссенс-мутации, т.е. мутации, приводящие к аминокислотным заменам и соответственно к утрате белком его функции, также могут быть ревертированы благодаря супрессорным мутациям, вызывающим ошибочное считывание мутантного кодона. Это может произойти в том случае, если тРНК, несущая нужную аминокислоту или любую другую, которая может быть включена в данный сайт белковой цепи, имеет антикодон, способный к спариванию с мутантным кодоном. Мутации, вызывающие сдвиг рамки считывания кодирующей последовательности, также могут быть супрессированы, если мутантные тРНК или рибосомы случайно транслируют два или четыре основания вместо трех.

Итак, ошибки трансляции могут компенсировать последствия нарушений кодирующей последовательности. Мутационные изменения в антикодоне тРНК-это наиболее распространенный механизм супрессии; изменения в других участках молекулы тРНК могут привести к неправильной этерификации аминокислот аминоацил-тРНК-синтетазами или ошибочному спариванию на рибосоме. Ошибки в трансляции могут возникать и в том случае, если в результате мутаций происходит изменение белков или РНК-компонент рибосом, участвующих в кодон-антикодоновом взаимодействии. Точность трансляции уменьшается и под действием некоторых химических соединений, которые связываются с рибосомными белками в 30S-субчастице. Такие случаи нарушения процесса трансляции приводят к более тяжелым последствиям.

8. Трансляция мРНК у эукариот

Процесс трансляции эукариотической мРНК в основном аналогичен таковому прокариотической мРНК. За некоторыми отмеченными выше исключениями, генетический код универсален и кодоны последовательно транслируются с помощью специфических аминоацил-тРНК-синтетаз на рибосомах. Есть, однако, и три явных различия, обусловленных определенными свойствами эукариотических клеток. Во-первых, аппараты транскрипции и трансляции у эукариот физически разобщены, поскольку транскрипция осуществляется в ядре, а трансляция - в цитоплазме. Во-вторых, на 5'- и 3'-концах эукариотических мРНК имеются особые структуры. И в-третьих, эукариотические мРНК, за исключением мРНК, транскрибируемых с ДНК геномов вирусов, обычно содержат только одну белок-кодирующую последовательность.

Структура и свойства участников трансляции эукариотической мРНК пока изучены гораздо хуже, чем у прокариот. И хотя у эукариот выделяют те же три стадии процесса - инициацию, элонгацию и терминацию, - на каждой из них требуется больше нерибосомных белковых факторов. Несмотря на эти различия, последовательности, кодирующие белки прокариот, нормально транслируются эукариотическими системами трансляции при условии соответствующей модификации их мРНК на 3'- и 5'-концах. И наоборот, кодирующие последовательности эукариот эффективно транслируются системами прокариот, если у них перед 5'-концом инициаторного кодона AUG имеется последовательность Шайна-Дальгарно. Это значит, что трансляционные аппараты обоих типов организмов могут осуществлять свои функции, несмотря на особенности нуклеотидных последовательностей мРНК из разных источников.

а. Особые модификации мРНК эукариот

У эукариотических мРНК, транскрибированных с ядерных или вирусных геномов РНК-полимеразой II, всегда модифицированы 5'-концы, которые в этом случае называют «кэпами». РНК, транскрибируемые эукариотическими РНК-полимеразами I и III, не кэпированы и имеют обычные 5'-фосфатные концы. У большинства мРНК, синтезируемых РНК-содержащими вирусами животных, также имеются кэпы, хотя они синтезируются вирусными РНК-транскриптазами. Многие некэпированные мРНК неэффективно транслируются эукариотическими белоксинтезирующими системами из-за слабого связывания рибосом с мРНК. Кэпирование происходит на 5'-нуклеозидтрифосфате вскоре после инициации синтеза РНК-транскриптов и задолго до его завершения.

На 3'-концах эукариотических мРНК имеются еще и полиаденилатные последовательности. Такой 3' - «хвост» из 50-200 аденилатных остатков не кодируется смысловыми последовательностями соответствующих генов, а присоединяется посттранскрипционно, после разрезания транскрипта в специфическом месте за сигналом терминации трансляции.

б. Инициация трансляции на 5'-кэпированных концах малыми рибосомными субчастицами

Как мы уже говорили, обязательным этапом при инициации трансляции прокариотической мРНК является диссоциация 70S-рибосомы; точно так же и 80S-рибосомы должны диссоциировать до начала трансляции эукариотических мРНК. Малая субчастица в комплексе со множеством белков-помощников, из которых один или несколько нужны для диссоциации рибосомы на составляющие субчастицы, связывает особую инициаторную met-тPHK. И вновь для связывания инициаторной аминоацил-тРНК необходимы GTP и особый белок - eIF-2. У эукариот, однако, met-TPHK не подвергается N-формилированию; но, как и у прокариот, структура тРНК отличается от структуры тPHKMMet. Комплекс 40S, содержащий met-тPHKIMet, GTP и целую армию других факторов eIF, связывается с мРНК вблизи кэпированного 5'-конца или прямо с этим концом; по крайней мере один из этих факторов узнает кэп и связывается с ним. Малая субчастица перемещается при помощи неизвестного пока механизма от кэпированного конца до первого кодона AUG. Никакой последовательности вблизи кодона AUG, аналогичной последовательности Шайна-Дальгарно, пока не обнаружено. Однако эффективность работы AUG в качестве инициатор-ного кодона зависит от наличия определенных фланкирующих нуклеотидов. Такой преинициаторный комплекс объединяется с 60S-субчастицей в ходе энерго- и фактор-зависимой реакции с образованием функционального комплекса инициации. Инициация белкового синтеза может регулироваться фосфорилированием и дефосфорилированием eIF-2.

в. Элонгация и терминация полипептидной цепи

Поэтапная трансляция последовательных кодонов с помощью аминоацил-тРНК у эу- и прокариот в принципе сходна. GTP и фактор элонгации eEF-1, соответствующий прокариотическому комплексу EF-Tu и EF-Ts, периодически поставляют рибосомам аминоацил-тРНК. GTP и eEF-2, являющиеся функциональными аналогами прокариотического EF-G, осуществляют транслокацию. Терминация трансляции у эукариот также происходит в одном из трех стоп-кодонов и сопровождается отделением свободных полипептидных цепей, мРНК и, возможно, 80S-рибосом от мРНК. По-видимому, всю серию терминационных событий осуществляют один фактор eRF и GTP.

В результате последовательных актов инициации образуются полисомы и одновременно, как и у прокариот, начинается трансляция множества кодирующих белки последовательностей. Заметное отличие трансляции у эукариот состоит в том, что клеточные мРНК обычно содержат одну-единственную кодирующую последовательность. Если в мРНК имеется несколько таких областей, то последующие либо вовсе не транслируются, либо транслируются неэффективно.

Кроме регуляции на уровне трансляции при образовании рибосомных белков осуществляется также регуляция по типу обратной связи при транскрипции оперонов рибосомных белков. Мы не будем обсуждать регуляцию этих оперонов на уровне транскрипции, а лишь отметим, что могут происходить репрессия и аттенуация транскрипции рибосомными субчастицами или даже целыми рибосомами. Наиболее вероятно, однако, что ключевым пунктом в регуляции скорости синтеза рибосом является образование рРНК. Таким образом, синтез рибосомных белков и тем самым сборка рибосом регулируются путем изменения содержания рРНК.

Страницы: 1, 2, 3, 4