Активность основных карбокмипептидаз в тканях пренатально алкоголизированных крыс

p align="left">Отмечаются половые отличия в формировании алкогольной зависимости.

В процессе развития экспериментального алкоголизма уровень потребления этанола выше у самок крыс по сравнению с самцами, хотя предпочтение быстрее формируется у самцов [106, 141, 214, 294]. В то же время есть данные о том, что самцы макак пьют больше, чем самки [343]; крысы обоего пола потребляют этанол в одинаковых количествах, но у самок дольше поддерживается предпочтение к этанолу [113]. У самцов мышей выше, чем у самок, чувствительность к хроническому седативному гипнотическому действию этанола [293]. У самок крыс при более медленном развитии зависимости от этанола происходит более быстрое восстановление, чем у самцов [148]. У женщин отмечается более высокий уровень алкоголя в крови, чем у мужчин при приеме одинакового количества этанола [186, 337]. У людей обоего пола уровень потребления алкоголя зависит от генотипа [106, 306, 320] и возраста [306].

Установлено, что у самок животных выше чувствительность к вызванному алкоголем повреждению печени, а также чаще встречается полинейропатия и мозжечковая атаксия, чем у самцов [337].

Во время отмены этанола после его хронического потребления ЦНС самок крыс по сравнению с самцами более восприимчива к повреждению полиаминовых нейронов [288], более чувствительна к антиконвульсантному действию нейростероидов [149], и проявляет больший ответ на острое введение этанола [148]. Однако приводятся данные о меньшей чувствительности самок к отмене этанола, что частично объясняется влиянием эстрогена [215]. Влиянием половых гормонов также можно объяснить и другие факты половых отличий при абстинентном синдроме [216, 217].

Хроническое потребление алкоголя самками изменяет соотношение стадий эстрального цикла, что свидетельствует о нарушении гипоталамических гормональных функций. У самок животных, по сравнению с самцами, отмечаются более выраженные изменения в кинетике этанола и ацетальдегида, что также способствует потреблению высоких доз этанола [4]. При развитии алкоголизма у самцов важна система положительного подкрепления мозга, а у самок - система, метаболизирующая этанол [4]. В частности имеются данные о половых отличиях экспрессии и стимуляции изоферментов АДГ [105, 215], причем в механизм этих отличий вовлекаются андрогены, оказывающие ингибирующее действие, а также прогестерон и эстроген, оказывающие стимулирующее действие [197]; алкоголизация не изменяет активность АДГ печени у животных обоего пола, но с повышением потребления этанола активность обоих изоферментов повышается.

Алкоголь по-разному действует на ГАМК-бензодиазепиновые рецепторы у этанол-зависимых мужчин и женщин [149, 240], но физиологические причины этого не ясны. Известно, что при хронической алкоголизации не изменяются уровни белка субъединиц ГАМК-рецепторов в коре этанол-зависимых самок крыс, в отличие от самцов, у которых эти уровни снижены [149].

У самцов и самок крыс наблюдается модулирующее (снижающее) влияние на предпочтение к этанолу, оказываемое дигидротестостероном и эстрадиолом [113].

Эстадиол и прогестерон влияют на способность этанола изменять кинетические параметры связывания м-опиоидных рецепторов в отделах мозга (гипоталамусе, среднем мозге и коре), что частично объясняет половые отличия алкогольных эффектов [133].

Таким образом, хроническая алкоголизация является причиной многочисленных нарушений на органном, тканевом, клеточном и молекулярном уровнях. В частности, отмечаются нарушения в функционировании ферментных систем. Для понимания механизмов изменения активности ферментов при алкоголизме и роли этих изменений в формировании алкогольной зависимости интересно сравнить влияние хронической этанольной интоксикации на активность ферментов обмена биологически активных пептидов в тканях интактных и пренатально алкоголизированных крыс. Многочисленные данные о половых отличиях при хронической алкоголизации требуют сравнения изменений активности ферментов при этом у животных разного пола.

1.2. Влияние пренатального хронического воздействия этанола на организм

Этанол оказывает многостороннее действие на организм не только особей, непосредственно его потребляющих, но и их потомства.

Пренатальная алкоголизация формирует так называемый алкогольный синдром плода или синдром эмбриофетопатии. По современным представлениям - это сумма патологических симптомов, обусловленных аномалиями развития плода и функциональными нарушениями в результате потребления алкоголя матерью во время беременности. Особенно уязвимы те стадии, когда происходит дифференцировка органов и систем плода.

Несмотря на то, что в системе «мать-плод» имеются механизмы, способствующие уменьшению эффекта алкоголизации матери во время беременности на плод [26, 90, 227], этанол проходит через плаценту и плод подвергается алкогольной интоксикации.

В целом, при влиянии алкоголя на потомство выделяют следующие изменения: 1) повышение биологического риска формирования алкоголизма; 2) разнообразные соматические нарушения вплоть до тяжелой органической патологии - алкогольной эмбриофетопатии; 3) нарушение поведения, эмоциональных и психических функций [6, 26, 64, 130].

Высокий риск заболевания алкоголизмом у потомков алкоголиков объясняется изменением функции генома. В частности, могут происходить нарушения в активности систем генов, участвующих в развитии и дифференцировке нервных клеток. Критическим моментом формирования нейрофизиологических механизмов алкогольной зависимости и толерантности может быть влияние на экспрессию «ранних» генов, например гена c-fos - белка, являющегося продуктом экспрессии «раннего» гена, выполняющего роль «третичного мессенджера». В ответ на экстрацеллюлярную стимуляцию изменяется активность других генов, что приводит к долговременным перестройкам в нейронах мозга. Несмотря на то, что фоновый уровень экспрессии гена c-fos в структурах головного мозга одинаков у пренатально алкоголизированных и контрольных животных, постнатальное введение этанола вызывает мощное усиление экспрессии этого гена у потомков алкоголиков крыс в отличие от интактных животных [8].

Божко Г. Х. и Волошин П. В. [238] считают, что нарушение структуры и функции генетического аппарата клеток преимущественно обусловлено действием ацетальдегида. Алкогольная интоксикация вызывает формирование поперечных ковалентных связей между комплементарными нитями ДНК и между хроматиновыми белками, вызывает изменение синтеза гистонов и негистоновых белков, нарушая структуру хроматина.

Несмотря на то, что не выявлен конкретный ген или аллели, ответственные за эффекты алкоголя, исследования показывают зависимость питьевого поведения и риска развития алкоголизма от генов, кодирующих ферменты метаболизма этанола. Отмечаются генетические различия активности этих ферментов [15, 22, 107].

Пренатальная алкоголизация вызывает гиперреактивность и изменение обратной связи ГГНС [177, 178, 182, 224, 282]. Это проявляется в однократном и/или длительном повышении уровня АКТГ и/или кортикостерона, в том числе и в ответ на стресс, увеличении чувствительности надпочечников к АКТГ, изменение чувствительности гипофиза к КРФ [182, 282]. Причем этот эффект пренатального влияния этанола зависит от пола животного. У эмбрионально алкоголизированных самцов крыс гипоталамус оказывает больший стимулирующий эффект, и/или гипофиз более чувствителен к веществам, повышающим секрецию АКТГ, по сравнению с пренатально алкоголизированными самками и контрольными животными [182]. Пренатально алкоголизированные самки имеют более высокий уровень тревожности и более высокий уровень кортикостерона, чем пренатально алкоголизированные и контрольные самцы и контрольные самки [280, 281, 291]. У пренатально алкоголизированных самок, но не у самцов дексаметазон вызывает повышение уровней АКТГ и кортикостерона [177]. Aird et. al. [109] предполагают организационное влияние половых гормонов на эти эффекты алкоголя. У пренатально алкоголизированных самок, в отличие от самцов, наблюдается изменение возрастной динамики уровня мРНК КРФ в гипоталамусе по сравнению с контрольными животными. Адреналэктомия матерей, комбинированная с пренатальной алкоголизацией, вызывает изменение возрастной динамики уровня мРНК КРФ и у самцов и у самок.

У пренатально алкоголизированных самцов снижается уровень мРНК ПОМК, а у самок не изменяется. Адреналеэктомия матерей возвращает уровень мРНК ПОМК у самцов к норме, а у самок - снижает [109].

Пренатальное воздействие этанола изменяет действие половых гормонов и влияет на репродуктивную функцию самок и самцов. Подавляется секреция эстрогена у самок крыс [322]; нарушается увеличение количества клеток, экспрессирующих мРНК проэнкефалина в гипоталамусе самок крыс в ответ на введение эстрогена, наблюдаемое в норме [239]; снижается уровень тестостерона у самцов, если он вводится до или во время периода диффференциации гипоталамуса и семенников [265].

Важно отметить, что в пренатальном периоде на развивающийся организм, помимо собственных нейрогормональных факторов и вводимого этанола, оказывают влияние гормоны и нейрогормоны матери и плаценты. Введение этанола в состав жидкого корма с 8-го дня беременности изменяет гормональный статус матери: содержание пролактина почти не изменяется, а тестостерона и прогестерона - повышается [64]. Эти изменения, естественно, отражаются на развитии плода.

Пренатальная алкоголизация, внося глубокие изменения в организм на клеточном, тканевом и органном уровнях, проявляется в изменении поведения. У пренатально алкоголизированных животных отмечается гиперреактивность [309, 299] или снижение двигательной активности [70, 83, 241] с уменьшением общемозговой и гиппокампиальной массы [132, 309] и уменьшением размера таламуса [241]. У самок крыс наблюдается большая исследовательская активность, т. е. более высокий уровень тревожности, чем у самцов, и более высокий уровень кортикостерона [281]. Druse M. J. et. al. [153] отмечают нарушение моторной функции у пренатально алкоголизированных крыс, сопутствующее повышению уровня мРНК проэнкефалина в стриатуме и прилегающих ядрах и аномалии в черном веществе.

Пренатальное воздействие этанола влияет на многие нейрохимические и клеточные компоненты развивающегося мозга. Разные отделы мозга отличаются реакцией на токсичный эффект этанола. В одном и том же отделе разные клеточные популяции тоже проявляют разную чувствительность к этанолу. Этанольная интоксикация в эмбриональном периоде нарушает деление, рост, дифференциацию и миграцию клеток, развитие астроглии и нейронально-глиальное взаимодействие, повреждает нейротрансмитерные системы и/или их рецепторы [190, 269], является причиной гибели нейронов в гиппокампе [226], мозжечке [134], коре [232, 268], в вестибулярном комплексе [154], снижает уровень миелинизации [284]. Она влияет на ДНК, РНК и белковый синтез, снижает уровень митоза, изменяет содержание и распространение некоторых цитоскелетных белков, цитозольных и мембранных гликопротеинов [191, 208]. Пренатальная алкоголизация нарушает содержание различных нейропептидов в отделах мозга, в частности, нейротрофина (фактора роста нервов) и нейропептида Y [114]. Пренатальная интоксикация влияет на ферментативную активность в ЦНС: изменяет посттрансляционную модификацию оксиазотсинтазы-1 и -3, снижая их активность [225], уменьшает активность протеинкиназы С, что является причиной глубоких и длительных дефицитов в клеточных сигнальных механизмах, связанных с синаптической пластичностью и формированием памяти [111], подавляет экспрессию мРНК ферментов катехоламинергической системы [331] и т. д.

Особый интерес, вызывает изменение уровней опиоидов при пренатальной алкоголизации. Пренатальное воздействие этанола избирательно изменяет содержание энкефалинов в разных регионах мозга: повышает уровень проэнкефалина в стриатуме и прилегающих ядрах [153]; снижает количество Met- и Leu-энкефалинов в гипоталамусе без изменения в коре, гиппокампе [69]; увеличивает содержание Met- и Leu-энкефалинов в бледном шаре без изменения их содержания в гипофизе [263]. Такие изменения уровней энкефалинов в мозге, по мнению некоторых авторов [69], формируются в процессе постнатального онтогенеза и обусловлены не прямым действием этанола на систему эндогенных опиоидов, а развивается в результате опосредованных реакций.

Таким образом, можно заключить, что пренатальная алкоголизация оказывает существенное разнообразное влияние на организм. В том числе и на содержание биологически активных пептидов. При этом практически отсутствуют данные о влиянии пренатальной этанольной интоксикации на ферменты обмена этих пептидов, что вызывает интерес для исследования.

1.3. Ферменты обмена регуляторных пептидов

1.3.1. Биологическая роль пептидаз

В регуляции функций организма, наряду с классическими медиаторами, важная роль принадлежит регуляторным факторам пептидной природы. Регуляторные пептиды широко распространены в различных тканях, в том числе и в нервной. Они принимают участие в нейрохимических механизмах, поддерживающих основные гомеостатические константы организма, формирующих и осуществляющих целенаправленное поведение, а также в процессах, контролирующих эмоциональную сферу, мотивацию, память [5, 10, 75, 93, 104]. Вероятно, именно биологически активным пептидам принадлежит важная роль в интеграции функциональных систем организма, обеспечении их слаженной работы в изменяющихся условиях окружающей среды. Они играют ключевую роль в регуляции иммунологической защиты, в запуске адаптивных защитных реакций при инфекции, повреждении тканей, стрессе, а также в формировании патологических состояний организма, в том числе и алклоголизма [55, 76, 230]. Многие нейропептиды вовлекаются в регуляцию возрастных изменений, в т. ч. и процессов полового созревания [12, 16, 25, 94, 95].

Одним из этапов метаболизма пептидов является ограниченный протеолиз, который играет главную роль, как в процессах их биосинтеза, так и в процессах инактивации. Пептидгидролазы, осуществляющие процессинг и деградацию пептидных регуляторов, обеспечивают функционирование и определенное соотношение их в организме.

Большинство предшественников нейропептидов включают последовательности пептидов, обладающих разной биологической активностью. То, какие именно пептиды будут образовываться из предшественника, зависит от набора протеиназ, действующих на молекулу предшественника, и от соотношения их активностей [185, 242, 261, 352].

Инактивация пептидов также осуществляется путем протеолиза и характеризуется следующими основными особенностями. Во-первых, один и тот же пептид может расщепляться разными пептидазами, а один и тот же фермент может превращать различные пептиды [1, 212]. Во-вторых, в отличие от классических медиаторов, продукты деградации пептидных регуляторов могут обладать собственной биологической активностью, которая может отличаться от активности исходного пептида как количественно, так и качественно [10].

При паракринном действии пептида активность внеклеточных пептидаз определяет время жизни пептида, расстояние, на которое он может продиффундировать, а, следовательно, и спектр мишеней, на которые он действует. Таким образом, при помощи протеиназ осуществляется регуляция физиологических эффектов пептидов на этапе биосинтеза и на этапе инактивации пептидов.

Особенность пептидной регуляции функционального состояния организма состоит в том, что в каждом участке в каждый момент времени должна поддерживаться необходимая концентрация определенных пептидов. Это может быть достигнуто точной и согласованной работой протеиназ, осуществляющих синтез и деградацию пептидов, т. е. поддержанием в головном мозге определенной пространственно-временной мозаики протеолитической активности. При изменении внешних условий, или каком-либо воздействии (например, алкоголизации) эта мозаика определенным образом изменяется, чтобы обеспечить работу функциональных систем организма в новых условиях [59].

В конечной стадии образования активных пептидов из неактивных предшественников и в начальных стадиях их деградации участвуют основные карбоксипептидазы - ферменты, отщепляющие остатки основных аминокислот (аргинина и лизина) с С-конца пептидов. К ним, в частности, относятся карбоксипептидаза Н, и недавно открытая ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза. Им принадлежит важная роль в регуляции уровней активных нейропептидов в организме [35, 40, 41, 43, 47, 48, 56, 101, 102, 131, 136, 151, 160, 172, 174, 200, 204, 292], чем обусловлен интерес к изучению этих ферментов, в том числе и при различных физиологических и патологических процессах, протекающих в организме [29, 30, 32, 39, 45, 49, 50, 52, 53, 54, 139, 140, 144, 175, 187, 196, 210, 213, 236, 237, 243, 253, 273, 283, 300, 303, 308, 311, 335, 336, 339, 340, 341].

1.3.2. Карбоксипептидаза Н

Карбоксипептидаза Н (КПН, энкефалинконвертаза, карбоксипептидаза Е, КФ 3.4.17.10) впервые была выделена и охарактеризована в 1982 г. Fricker L.D. и Snyder S.H. из мозга, гипофиза и хромаффинных гранул надпочечников быка [172].

Карбоксипептидаза Н является гликопротеином с Mr 50000 - 55000, состоит из одной полипептидной цепи. Это тиолзависимый металлофермент, в активном центре которого находится ион Zn2+ [203, 204]. Фермент имеет оптимум рН 5,5-6,0 [151, 188, 205, 312, 350], pI 4,9 [251], ингибируется Cu2+, Hg2+, Cd2+, п-хлормеркурфенилсульфатом, АПМЯК, 2-меркаптометил-3-гуанидилэтилтиопропановой кислотой, ЭДТА и 1,10-фенантролином [37, 151, 174, 200, 204]. Наиболее эффективными ингибиторами являются ГЭМЯК и ГПЯК с Ki 8,8 и 7,5, соответственно [145, 169, 301, 327]. КПН ингибируется Met- и Leu-энкефалинами (Ki 12,0 - 5,5), веществом Р, вазопрессином, окситоцином (при концентрации 2 - 20 мМ), тиреотропин-рилизинг-фактором [202, 287, 302]. Лизин и аргинин являются конкурентными ингибиторами КПН. Ki для аргинина и лизина равны, 4,6±1,3 и 7,6±1,9 [199], соответственно. Бромацетил-D-Arg, необратимый ингибитор КПВ и КПN, также ингибирует и КПН [169]. Ионы цинка, кальция, магния, N-этилмалеимид и ФМСФ не влияют на активность КПН [37, 151]. Фермент активируется ионами Co2+ в зависимости от рН среды в 5-10 раз, ионами Ni2+ - в 2-3 раза [37, 145, 151, 174, 204, 301, 325, 327]. Агрегация, конформационные изменения и мембранная ассоциация КПН зависят от рН среды и концентрации ионов Ca2+ [121, 318]. Уменьшение pH и увеличение концентрации ионов Ca2+ индуцируют агрегацию данного фермента и его ассоциацию с мембранами [121, 318]. Ионы Ca2+ при повышенной температуре дестабилизируют КПН [274].

КПН обладает практически абсолютной специфичностью по отношению к пептидным субстратам с С-концевыми остатками основных аминокислот. Фермент хорошо отщепляет остатки -Lys и -Arg от Arg8-вазопрессин-Gly-Lys-Arg, 125I-Met-энкефалин-Arg, 125I-Met-энкефалин-Lys, гиппурил-L-Arg, Leu-энкефалин-Arg, даларгина, остатки -Lys15-Lys16-Arg17 с С-конца АКТГ1-14 [46, 48, 86, 151, 200, 204, 344], но с очень низким сродством отщепляет остаток гистидина с карбоксильного конца проокситоцина [277, 317].

КПН существует в двух формах: растворимой и мембраносвязанной. Обе формы являются гликопротеинами. Они имеют идентичную субстратную специфичность и чувствительность к групп-специфичным реагентам. Растворимая форма КПН более активна, чем мембраносвязанная. Mr мембранной формы 55 000 - 57 000, Mr растворимой формы 53000 - 57000 [145, 188, 193, 200, 205, 206, 325, 330, 350]. Различия в молекулярной массе мембраносвязанной и растворимой форм КПН, по-видимому, связано с наличием у первой так называемого ”мембранного якоря”. С-концевая область мембраносвязанной КПН (51 аминокислотный остаток) образует амфифильную -спираль, которая и может служить гидрофобным ”мембранным якорем” [166, 270, 338]. В секреторных гранулах КПН связывается с детергент-устойчивыми липидными доменами мембран, богатыми гликосфинголипидами и холестеролом [150]. Такая ассоциация КПН с мембранами является необходимым условием для выполнения сортирующей функции в регулируемом секреторном пути [150]. Растворимая и мембраносвязанная формы КПН вероятно отличаются механизмами, регулирующими их активность [33]. В настоящее время обнаружено несколько видов мембраносвязанной и растворимой форм фермента, отличающихся молекулярной массой, значением pI [37, 145, 286]. Соотношение мембраносвязанной и растворимой форм КПН в разных клетках и тканях отличается [161, 285]. По некоторым данным мембраносвязанная форма может переходить в растворимую при повышении рН [121, 318], при холестероловом истощении мембран [150]. По данным Fricker и Devi [167] в секреторных везикулах мембраносвязанная форма КПН может переходить в растворимую путем протеолитического удаления С-концевой последовательности КПН. Фермент, осуществляющий этот переход, активируется ионами кальция. Вероятно, превращение мембраносвязанной формы в растворимую может регулироваться ионами кальция [274], концентрация которых в клетке изменяется в ответ на различные стимулы, что, в свою очередь, влияет на секрецию нейропептидов [116]. С другой стороны, Parkinson [285, 286] высказывает сомнения относительно возможности перехода мембраносвязанной формы в растворимую посредством С-концевого протеолиза.

Ген КПН клонирован и секвенирован [110, 165, 219, 220, 253, 255, 300, 316]. В последовательности гена КПН присутствуют регуляторные участки, повышающие активность транскрипции [157, 218, 220, 237, 316], однако уровень мРНК препроКПН и нейропептидов коррелирует не всегда [170, 171, 187].

При мутации в гене, кодирующем КПН (единичная точечная мутация Ser202 на Pro), уменьшается эффективность процессинга прогастрина [236, 336], нарушается процессинг проинсулина (и нарушению внутриклеточного фолдинга КП Н) [139, 210, 273, 339, 340], синтеза соматостатина и хромогранина А [196], подавляется процессинг проглюкагона и глюкагон-подобного пептида 1 [175], происходит нарушение внутриклеточного транспорта проопиомеланокортина и гормона роста [311], созревания пронейротензина и промеланоцитстимулирующего гормона [303]. Это приводит к многочисленным эндокринным нарушениям, включая гиперинсулинемию и бесплодие [140, 243, 273]. У человека при диабете (T2DM) синтезируется КПН, кодированная мутантными генами, с измененными свойствами (рН оптимумом, субстратной спечифичностью) [137].

КПН синтезируется в виде неактивного предшественника с Mr 75000, состоящего из 476 аминокислотных остатков [206, 300, 319]. Затем он подвергается С- и N-концевому посттрансляционному процессингу [192, 201, 300].

Активность КПН в мозге и тканях коррелирует с уровнем мРНК КПН [124, 167] и в целом соответствуют распределению биологически активных пептидов и их предшественников [48, 163, 164]. Наиболее высокие уровни мРНК КПН обнаружены в передней и промежуточной долях гипофиза, хромафинных гранулах надпочечников, островках Лангерганса поджелудочной железы [108, 144, 151, 172, 173, 174, 193, 200, 207, 246, 251, 279, 285, 323, 330, 344]. Несколько ниже уровни мРНК КПН обнаружены в задней доле гипофиза, отделах мозга, слюнных железах [174, 246, 250, 285, 323, 330]. Наиболее низкие уровни выявлены в стволовой части головного мозга, спинном мозге, легких, сердце, желудочно-кишечном тракте, печени и почках [248, 249]. Фермент также обнаружен в центральных нейронах миндалины [246]. Тканевое и региональное распределение КПН сходно у разных видов животных и человека [168, 221]. Установлено, что КПН ассоциирована со структурными элементами эндоплазматического ретикулума, комплекса Гольджи и секреторными везикулами, где протекает процессинг предшественников различных биологически активных пептидов [36, 163]. Имеются сведения о том, что эндоплазматический ретикулум и элементы комплекса Гольджи содержат мембранную форма КПН (57000), секреторные гранулы - растворимую форму кпн (54000) и мембранную [192]. В регуляторном секреторном пути КПН выполняет сортирующую функцию [139, 140, 183]. КПН участвует в процессинге многих регуляторных пептидов: опиоидных [35, 48, 56, 172, 174, 200, 204], пептидных гормонов гипофиза, гипоталамуса, желудочно-кишечного тракта, плаценты, фактора роста [35, 151, 200, 204, 292], пептидов, имеющих единого предшественника proSAAS [131, 160], пептидов (включая проэнкефалин, проопиомеланокортин, протахикинины А и В, хромогранин А и В, секретогранин), с образованием более 100 новых пептидов [136] и т. д.

Уровень мРНК КПН и активность фермента в культурах клеток способны изменяться в ответ на внешние воздействия: при смене условий освещенности [308]; под действием фактора роста нервов [144, 187, 237, 283, 335]; раствора KCl [144, 170]; бромкриптина [283]; дексаметазона [39, 300]; кортикотропин-рилизинг-фактора [253, 300]; гидрокортизона [39]. Кратковременная общая ишемия снижает, а длительная повышает активность КПН и уровень ее мРНК в гипоталамусе и коре крыс [213]. Однократный эмоционально-болевой стресс вызывает повышение карбоксипептидазно-Н-подобной активности в гипофизе и сыворотке крыс, длительный - повышение в гипофизе и снижение в сыворотке [45]. Активность КПН через 6 часов введения этанола (в дозе 4 г/кг) повышается в гипофизе и снижается в сыворотке, через 18 часов - повышается в гипофизе и сыворотке [45]. Длительное воздействие эмоционального стресса, этанола и транквилизаторов (диазепама и резерпина) повышает активность КПН в гипофизе, гипоталамусе и стриатуме крыс [341]. В некоторых отделах головного мозга крыс совместное воздействие этанола и стресса вызывает гиперактивацию КПН, причем изменение активности зависит от дозы этанола и вида стрессирующего воздействия [32]. Отмечается различие в региональной активности КПН мозга и периферических тканей у крыс с различным влечением к этанолу [54], и у мурицидных и немурицидных крыс [53]. Отмечается повышение активности КПН у немурицидных крыс при потреблении этанола и его отмене [53]. Таким образом, показано вовлечение КПН в определение агрессивности [52], в ответ на различные стрессирующие воздействия [29, 30, 49, 50, 52], введение гормонов [39] и транквилизаторов [187, 341], предрасположенности к потреблению этанола [54], в развитие физической зависимости от него [17, 44, 53].

Имеются также данные о половых отличиях в активности КПН [101]. Половые гормоны влияют на активность КПН в отделах гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадной системы мышей: активность фермента у контрольных животных у самок выше, чем у самцов; экзогенно вводимые тестостерон и прогестерон по-разному снижают активность КПН в тканях животных разного пола [88].

Вовлечение КПН в формирование алкогольной зависимости [17, 32, 44, 45, 53, 54, 341], его участие в процессинге многих биологически активных пептидов [35, 48, 56, 131, 136, 151, 160, 172, 174, 200, 204, 292] обусловливают интерес к исследованию активности данного фермента и его участия в формировании толерантности к этанолу и предрасположенности к алкоголизму в постнатальном периоде у животных, испытавших пренатальное воздействие этанола.

1.3.3. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза

Первые упоминания о существовании фермента, отщепляющего аргинин и лизин с С-конца пептидов, но в то же время отличающегося от всех известных металлокарбоксипептидаз, относятся к 1993 году. Более подробные сведения появились в 1995 году [40, 41].

Фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза (ФМСФ-КП) - экзопептидаза, отщепляющая остатки основных аминокислот с С-конца пептидов. В частности, она отщепляет остаток аргинина от дансил-Phe-Leu-Arg [40], Cbz-Gly-Gly-Arg, Met5-энкефалина-Arg6 [47] с образованием, соответственно, дансил-Phe-Leu, Cbz-Gly-Gly, Met5-энкефалина. Дальнейшего расщепления образовавшихся продуктов не происходит. Фермент имеет Mr 100000 - 110000 и проявляет максимальную активность при pH 5,0-6,0 [40]. Фенилметилсульфонилфторид и п-хлоромеркурбензоат полностью ингибируют его. Иодоацетамид снижается карбоксипептидазную активность только на 40%. Другой реагент на SH-группы (N-этилмалеимид), хелатирующий агент ЭДТА и специфический ингибитор КПН ГЭМЯК, а также ионы Co2+ не оказывают влияния на активность фермента. ФМСФ-КП инактивируется при нейтральных и слабощелочных значениях pH, но стабилизируется NaCl [40]. Km для синтетических субстратов дансил-Phe-Leu-Arg и дансил-Phe-Ala-Arg равна 48 и 96 мМ, соответственно.

ФМСФ-КП по своим физико-химическим свойствам схожа с лизосомальной карбоксипептидазой А (лизосомальная КПА, катепсин А, КФ 3. 4. 16. 1), но отличается от нее субстратной специфичностью и распределением активности в тканях и отделах мозга [127, 147, 195, 256, 257, 262, 289].

Тканевое и региональное распределение ФМСФ-КП имеет некоторые видовые отличия [38, 42, 43, 101, 102], но наибольшая активность у всех исследованных видов животных (ежа европейского, кошки, крысы, мыши) отмечена в надпочечниках и гипофизе [38, 42, 43, 88, 101, 102]. В отделах головного мозга активность ФМСФ-КП ниже, чем в периферических тканях и еще ниже, чем в гипофизе [38, 42, 43, 88]. Предполагается, что разных тканях ФМСФ-ингибируемая КП может быть представлена разными изоферментами. Поэтому выявленные отличия могут быть обусловлены разными соотношениями изоферментов у животных разных видов [43]. В мозге наибольшая активность фермента отмечается в отделах с преобладанием серого вещества (обонятельных луковицах, больших полушариях) или с высоким содержанием нейропептидов (гипоталамусе, стриатуме).

Страницы: 1, 2