Активность основных карбоксипептидаз в тканях мышей при введении тестостерона и прогестерона

p align="left">В гипоталамусе самок при введении как тестостерона (в дозах 3 и 30 мг на кг массы), так и прогестерона (в дозах 1 и 10 мг на кг массы), динамика изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП одинакова: снижение в интервале 0,5-4 ч и далее отсутствие изменений до 24 ч. В надпочечниках время после инъекции тестостерона в дозе 3 мг на кг массы не влияет на активность исследуемой карбоксипептидазы. Прогестерон в дозе 1 мг на кг массы вызывал плавное снижение активности фермента в интервале 0,5-24 ч. После введения высоких доз половых стероидных гормонов (30 мг на кг массы тестостерона и 10 мг на кг массы прогестерона) динамика изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП в этом отделе ГГНГС была одинаковой: снижение активности к 4 ч и отсутствие изменений через 24 ч. В гипофизе и яичниках после введения тестостерона (как высокой, так и низкой дозы) активность ФМСФ-ингибируемой КП снижалась к 4 ч и не изменялась до 24 ч. После инъекций обеих доз прогестерона в гипофизе активность не изменялась в интервале 0,5-4 ч и снижалась к 24 ч, а в яичниках происходило постепенное снижение активности фермента в промежутке от 0,5 до 24 ч.

Согласно результатам дисперсионного анализа (таблица 3.2.2.3) доза прогестерона, а также взаимодействие дозы и времени после инъекции, не влияют на активность ФМСФ-ингибируемой КП в ГГНГС самок мышей.

Таким образом, как и при введении тестостерона активность КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП в ГГНГС самок мышей не зависит от дозы вводимого гормона (в исследованном диапозоне доз).

Необходимо отметить, что действие прогестерона на активность двух исследуемых карбоксипептидаз отличается. После введениия прогестерона в дозе 1 мг на кг массы в гипоталамусе активность КП Н оставалась неизменной в интервале 0,5-4 ч, затем снижалась к 24 ч, а активность ФМСФ-ингибируемой КП снижалась к 4 ч и далее не изменялась до 24 ч. В гипофизе активность ФМСФ-ингибируемой КП плавно уменьшалась к 24 ч, тогда как активность КП Н возрастала через 4 ч после инъекции. В надпочечниках и яичниках происходило постепенное снижение активности ФМСФ-ингибируемой КП к 24 ч. Статистически достоверной зависимости активности КП Н от времени после инъекции гормона не установлено. После введения прогестерона в дозе 10 мг на кг массы в гипофизе динамика изменения активности обеих карбоксипептидаз одинакова: неизменность в интервале 0,5-4 ч и снижение к 24 ч. В гипоталамусе активность КП Н была постоянной в итервале 0,5-4 ч и снижается к 24 ч, а активность ФМСФ-ингибируемой КП снижалась к 4 ч и оставалась на этом уровне до 24 ч. В яичниках активность КП Н повышалась к 4 ч, затем снижалась к 24 ч, а активность ФМСФ-ингибируемой КП постепенно снижалась к 24 ч.

Таким образом, активность обеих исследуемых карбоксипептидаз как в случае тестостерона, так и в случае прогестерона, практически не зависела от дозы вводимого полового гормона (в исследованном диапозоне доз).

3.3. Активность основных карбоксипептидаз у самцов мышей при введении тестостерона и прогестерона

В связи с отсутствием зависимости изменения активности КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП от дозы вводимого гормона у самок, у самцов активность ферментов исследовалась только при введении тестостерона в дозе 3 мг на кг массы и прогестерона в дозе 1 мг на кг массы.

3.3.1. Активность карбоксипетидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при введении тестостерона в тканях самцов мышей

Результаты исследования активности КП Н в ГГНГС самцов при введении тестостерона в дозе 3 мг на кг массы представлены на рис. 3.3.1. Через 0,5 и 4 ч после инъекции активность фермента в гипофизе по сравнению с контрольными самцами была ниже примерно на 40%. В гипоталамусе и надпочечниках на все исследованные временные интервалы активность КП Н не отличалась от контроля. В семенниках активность исследуемой карбоксипептидазы через 4 ч была в 1,9 раза выше, а через 0,5 и 24 ч не отличалась от таковой у контрольных животных.

Данные об изменении активности ФМСФ-ингибируемой КП при введении тестостерона в дозе 3 мг на кг массы представлены на рис. 3.3.2. По сравнению с контрольной группой, статистически достоверное увеличение активности ФМСФ-ингибируемой КП обнаружено только в гипофизе (на 21%) через 24 ч. В остальных отделах ГГНГС самцов изменений активности ФМСФ-ингибируемой КП не выявлено.

Таким образом, при введении тестостерона в дозе 3 мг на кг массы в гипофизе самцов активность КП Н снижалась в начальный период времени (0,5-4 ч), в то время как активность ФМСФ-ингибируемой КП повышалась через 24 ч.

3.3.2. Активность карбоксипетидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при введении прогестерона в тканях самцов мышей

При введении прогестерона в дозе 1 мг на кг массы, в гипофизе через 0,5 ч активность КП Н была на 25% ниже, чем у контрольных самцов (рис. 3.3.3). В остальных отделах ГГНГС самцов изменений активности этого фермента не обнаружено.

У самцов, которым вводили прогестерон, активность КП Н в семенниках через 0,5 ч была в 3,3 раза выше, а через 4 и 24 ч - в 1,5-2 раза ниже, чем у животных, которым вводили тестостерон в дозе 3 мг на кг массы (рис. 3.3.3). В остальных отделах ГГНГС самцов отличий между активностью КП Н после введении тестостерона или прогестерона не обнаружено.

Прогестерон достоверно увеличивал активность ФМСФ-ингибируемой КП по отношению к контрольным животным в надпочечниках через 0,5 ч на 28%, а в семенниках - через 0,5 и 4 ч после инъекции, примерно, на 40% (рис. 3.3.4).

После введения прогестерона в гипоталамусе, гипофизе и надпочечниках влияния времени после инъекции на активность как КП Н, так и ФМСФ-ингибируемой КП не обнаружено (таблица 3.3.1). В семенниках время после инъекции достоверно влияло на активность КП Н: активность плавно снижалась к 24 ч.

Достоверной зависимости активности КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП от времени после введении тестостерона во всех отделах ГГНГС самцов не обнаружено (таблица 3.3.1).

3.4. Активность карбоксипетидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы in vitro при действии тестостерона и прогестерона

Для выяснения механизма действия тестостерона и прогестерона на активность основных карбоксипептидаз в ГГНГС мышей in vivo было исследовано влияние данных половых стероидов in vitro (таблица 3.4).

Исходя из полученных данных можно сделать вывод, что ни один из гормонов не влияет на активность исследуемых ферментов. Другими словами, прямое влияние тестостерона или прогестерона на молекулы КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП, по-видимому, исключено.

Вместе с тем, в опытах in vivo активность обоих ферментов изменялась при введении гормонов. Следовательно, влияние тестостерона и прогестерона in vivo на активность КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП опосредуется какими-то внутриклеточными механизмами.

Сопоставление результатов дисперсионного анализа влияния времени после введения у самцов и самок (таблица 3.5.1) позволяет заключить, что тестостерон не влияет на динамику активности КП Н ни у самцов, ни у самок. В то же время, во влиянии прогестерона на активность КП Н в половых железах выявлены отличия: в яичниках гормон не влиял на динамику изменения активности, а в семенниках наблюдалось плавное снижение активности КП Н. Следует отметить, что в надпочечниках ни одно из вводимых веществ достоверно не влияло на динамику активности КП Н у животных обоего пола.

Результаты дисперсионного анализа влияния времени на активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях самцов и самок при введении различных веществ представлены в таблице 3.5.2. Достоверного влияния времени на активность ФМСФ-ингибируемой КП ни в одном отделе ГГНГС самцов не обнаружено.

С другой стороны, практически во всех изученных случаях наблюдается статистически значимая временная динамика активности ФМСФ-ингибируемой КП в тканях самок (таблица 3.5.2). При введении оливкового масла во всех отделах ГГНГС, исключая гипофиз, наблюдается повышение активности фермента к 0,5 ч и снижение к 4 ч. В интервале 4-24 ч активность ФМСФ-ингибируемой КП не изменялась. При введении оливкового масла активность исследуемого фермента была постоянной в интервале 0,5-24 ч. Оба половых гормона влияли на динамику активности исследуемого фермента в гипофизе, по сравнению с таковой при введении оливкового масла. После инъекции тестостерона активность повышалась к 0,5 ч, затем снижалась к 4 ч и не изменялась в интервале 4-24 ч. В тоже время, активность ФМСФ-ингибируемой КП после введения прогестерона не изменялась в интервале 0,5-4 ч и снижалась к 24 ч.

Следует также отметить, что в случае введения прогестерона в яичниках происходило плавное снижение активности ФМСФ-ингибируемой КП к 24 ч, тогда как в случае введения оливкового масла снижение наблюдалось уже к 4 ч.

Сопоставление результатов влияния тестостерона в дозе 3 мг на кг массы и прогестерона в дозе 1 мг на кг массы в ГГНГС самцов и самок мышей позволяет выделить следующие особенности.

При введении прогестерона активность КП Н в семенниках и активность ФМСФ-ингибируемой КП в яичниках изменялись сходным образом: плавное снижение к 24 ч (табл. 3.5.1. и 3.5.2).

В половых железах через 0,5 ч после инъекции прогестерон у самцов повышал, а тестостерон у самок - снижал активность ФМСФ-ингибируемой КП (рис. 3.3.4. и 3.2.3). При этом активность КП Н через 4 ч после инъекции у самцов повышается при введении тестостерона, а у самок - прогестерона (рис. 3.3.1. и 3.2.5).

В гипофизе через 4 ч активность КП Н у самцов при введении тестостерона снижается, а у самок при введении прогестерона повышается (рис. 3.3.1. и 3.2.5).

В гипофизе через 0,5 ч тестостерон у самок повышал активность КП Н, а у самцов снижал. В этом же органе, но через 24 ч после введения тестостерон у самок снижал активность ФМСФ-ингибируемой КП, а у самцов - повышал (рис. 3.2.1., 3.3.1. и 3.2.3., 3.3.2).

Выявленные отличия во влиянии половых стероидов на активность исследуемых карбоксипептидаз у самцов и самок могут быть, вероятно, связаны с отличиями в чувствительности ГГНГС самцов и самок к половым гормонам [75, 94], а также с половыми отличиями в функционировании пептидергических систем [2, 40].

Необходимо заметить, что влияние прогестерона и тестостерона как у самцов, так и у самок, всегда было однонаправленным. Возможно это обусловлено тем, что в организме животных первый является предшественником второго [24, 27, 32, 39], и следовательно, многие эффекты прогестерона опосредуются его превращением в тестостерон.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Известно, что нейропептиды контролируют различные функции организма и участвуют во многих физиологических процессах, в том числе и связанных с размножением [55, 101, 126, 203, 207, 219]. Они регулируют синтез и секрецию половых стероидных гормонов [23, 24, 32, 39]. В то же время половые стероидные гормоны оказывают существенное влияние на функционирование пептидергических систем [2, 277]. Они влияют на уровень синтеза и секреции гонадотропинов [2], гонадотропин рилизинг-фактора [202], пролактина [38], АКТГ [277], рилизинг-фактора АКТГ [64], -эндорфина [277] и др. С другой стороны, уровень биологически активных пептидов зависит от активности ферментов, участвующих в их обмене [1, 5, 22, 123, 147, 146, 148, 152]. Исходя из этого, очевидно, что изучение активности КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП при введении тестостерона и прогестерона представляет значительный интерес, как для понимания роли ферментов, так и для понимания механизмов функционирования нейропептидов.

Приведенные в настоящей работе данные о распределении активности КП Н в ГГНГС самцов и самок мышей хорошо соотносятся с распределением активности фермента у других видов животных [112, 113, 121, 122]: максимальный уровнь обнаружен гипофизе и гипоталамусе, минимальный - в надпочечниках и половых железах. Таким образом, активность КП Н выше в тех отделах ГГНГС, в которых выше концентрация нейропептидов [169]. Это хорошо согласуется с биологической ролью фермента - участием в процессинге предшественников биологически активных пептидов.

В настоящее время имеются сведения о распределении активности ФМСФ-ингибируемой КП в ЦНС и периферических тканях ежа [13], крысы [12, 44, 45] и кошки [8]. Данные о распределении активности исследуемого фермента в ГГНГС мышей согласуются с таковыми у других видов животных [8, 12, 13, 44, 45]. У всех изученных видов млекопитающих наибольшая активность ФМСФ-ингибируемой КП обнаружена в надпочечниках, половых железах и гипофизе, то есть в органах, связанных с образованием нейропептидов, участвующих в нейрогуморальной регуляции функций организма. Установлено, что яичники продуцируют многие нейропептиды, в том числе окситоцин [4], релаксин [43], инсулиноподобные факторы роста [282], эндорфины и энкефалины [80], а функции семенников модулируются опиоидными пептидами [128]. Кроме того, известно, что клетки семенников способны связывать вещество Р [257]. Все это позволяет сделать предположение о возможном участии ФМСФ-ингибируемой КП в процессинге биоактивных пептидов.

Следует отметить, что активность обеих карбоксипептидаз у самок выше, чем у самцов. Активность КП Н во всех отделах ГГНГС самок в 2,5-4 раза выше, чем у самцов. В то же время, активность ФМСФ-ингибируемой КП в гипофизе и надпочечниках самок выше, чем у самцов в 3,6-4,5 раза, а в гипоталамусе и половых железах - в 5,4-12 раз. Полученные результаты согласуются с данными о половых отличиях в активности исследуемых карбоксипептидаз в ГГНГС крыс [44]. Не исключено, что выявленные различия связаны с половыми отличиями в функционировании ГГГС, ГГНС и пептидергических систем [2, 40, 55].

Обнаружено (таблица 3.1.1. и 3.1.2), что в гипофизе мышей, в котором синтезируются пептидные гормоны, активность КП Н примерно в 2 раза выше активности ФМСФ-ингибируемой КП. При этом в надпочечниках, в которых синтезируются преимущественно энкефалины, наоборот, активность ФМСФ-ингибируемой КП приблизительно в 10 раз выше таковой КП Н. Подобное различие может быть обусловлено разным набором и уровнем нейропептидов в гипофизе и надпочечниках [169], а также отличиями в субстратной специфичности КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП [11, 12, 44, 45, 118, 147].

Влияние тестостерона и прогестерона на активность как КП Н, так и ФМСФ-ингибируемой КП, у мышей обоего пола всегда было однонаправленным. Обнаружено, что в гипофизе самок активность КП Н при введении тестостерона в дозе 3 мг на кг массы увеличивалась через 0,5 ч после инъекции, а при введении прогестерона в дозе 1 мг на кг массы - через 4 ч. Известно, что прогестерон в организме служит предшественником тестостерона [32, 199]. Вероятно, влияние прогестерона опосредуется превращением в тестостерон. Это предположение подтверждается также отсутствием влияния вида гормона на активность исследуемых карбоксипептидаз (таблица 4.1).

Таблица 4.1. Дисперсионный анализ влияния вида гормона на активность основных карбоксипептидаз в ГГНГС мышей.

Фермент	Отдел ГГНГС	Критерий Фишера, самцы	Критерий Фишера, самки
Карбоксипептидаза Н	Гипоталамус	0,1	1,0
	Гипофиз	0,1	0,1
	Надпочечники	0,9	4,1
	Половые железы	1,3	1,9
ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза	Гипоталамус	0,1	0,8
	Гипофиз	1,3	1,5
	Надпочечники	1,1	0,8
	Половые железы	4,1	4,5*

Примечание. Звездочкой показана достоверность критерия Фишера: * - p<0,05.

У самцов (таблица 4.1) не обнаружено статистически достоверных отличий между влиянием тестостерона и прогестерона. У самок (таблица 4.1) влияние вида гормона на активность ФМСФ-ингибируемой КП выявлено только в яичниках. Изменения активности КП Н не зависело от вида гормона. Возможно, это связано с тем, что у самцов, по-видимому, большая часть экзогенного прогестерона превращается в тестостерон и таким образом оказывает свое влияние. В то же время, у самок влияние прогестерона, вероятно, в меньшей степени обусловлено превращением в тестостерон. Половые железы, как основные источники половых стероидных гормонов, по-видимому, одними из первых подвержены действию экзогенных стероидов.

Изложенное выше, а также то, что активность ФМСФ-ингибируемой КП в половых железах значительно превосходит активность КП Н, объясняет наличие достоверного влияния вида вводимого стероидного гормона на активность исследуемого фермента только в яичниках.

У самок влияние тестостерона и прогестерона на активность КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП более выраженное, чем у самцов. Принимая во внимание факт, что у самок активность обоих ферментов выше, чем у самцов, можно сделать предположение: подобные различия связаны с особенностями функционирования ГГГС и ГГНС у самцов и самок [2, 40, 55].

Pekary A.E. и соавт. обнаружили, что диета, обедненная цинком (6 мкг цинка на 1 г диеты против 36 мкг цинка на 1 г диеты у контрольных крыс) способствует снижению активности КП Н в репродуктивных органах [224]. При этом уменьшается концентрация тиреотропин-рилизинг-фактора (ТРФ) в эпидидимусе и семенниках. Экзогенный тестостерон увеличивает концентрацию ТРФ у животных, в рационе которых был недостаток цинка [224]. В наших исследованиях обнаружено, что через 4 ч после введения тестостерона в семенниках происходило увеличение активности КП Н. Не исключено, что данный эффект тестостерона может опосредоваться ТРФ.

В гипоталамусе самок обнаружено снижение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 4 и 24 ч и активности КП Н через 24 ч после введения как тестостерона, так и прогестерона. Известно, что тестостерон в некоторой степени ингибирует секрецию аргинин-вазопрессина из паравентрикулярного и супраоптического ядер гипоталамуса [175]. Имеются сведения о том, что гонадотропин-рилизинг-фактор (ГнРФ) синтезируется в виде высокомолекулярного предшественника - препрогонадотропин-рилизинг-фактора (препроГнРФ) [32]. Последний состоит из сигнального пептида (23 аминокислотных остатка), ГнРФ (10 аминокислотных остатка), остатка глицина, сайта процессинга из двух аминокислотных остатка - Lys-Arg и гонадолиберин-ассоциированного пептида (56 аминокислотных остатка). В ходе посттрансляционной модификации происходит отщепление сигнального пептида, а также разделение ГнРФ и гонадолиберин-ассоциированного пептида в сайте процессинга. Субстратная специфичность обеих исследуемых карбоксипептидаз позволяет предположить их участие в процессинге препроГнРФ. Поскольку эгзогенные тестостерон и прогестерон по механизму отрицательной обратной связи снижают синтез и секрецию ГнРФ [24, 27, 32, 39], то снижение активности КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП в гипоталамусе самок может являться одним из способов реализации обратной связи между уровнями половых стероидов и ГнРФ.

Известно, что действие половых стероидов на многие внутриклеточные процессы обусловлены изменением экспрессии генов ключевых белков (ферментов). Поэтому модуляция активности КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП, наблюдаемая при введении тестостерона или прогестерона, вероятно, связана с влиянием этих половых стероидов на уровень экспрессии генов исследуемых карбоксипептидаз. Возможно, поэтому влияние тестостерона и прогестерона на активность КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП более выражено через 24 ч.

Наиболее сильное влияние обоих половых стероидов на активность КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП у животных обоего пола наблюдалось в гипофизе и половых железах. Последние являются местом синтеза и основным объектом воздействия половых гормонов. В гипофизе синтезируются ЛГ и ФСГ - гормоны, ответственные за синтез и секрецию как тестостерона, так и прогестерона. Повышение уровня тестостерона и прогестерона в крови при парентеральном введении, по-видимому, в первую очередь затрагивает гипофиз и половые железы. Есть данные об участии прогестерона в контроле тонической секреции гонадотропинов у самок [40]. Krey L.C. и соавт. обнаружили, что в присутствии прогестерона секреция ФСГ клетками гипофиза in vitro изменялась следующим образом: возрастала до 6 ч, оставалась на этом уровне через 9 ч и снижалась через 24 ч [168]. Таким образом, изменение активности исследуемых карбоксипептидаз у самок мышей согласуется с изменением секреции ФСГ в присутствии прогестерона. Возможно, что изменение активности исследуемых карбоксипептидаз, которые участвуют в процессинге предшественников гонадотропных гормонов гипофиза, является одним из механизмов снижения синтеза и секреции ЛГ и ФСГ половыми стероидами.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8